小鼠卵丘顆粒細胞-卵子復合物脂類代謝及基因調控.pdf

1、第一章:正常小鼠圍排卵期卵丘顆粒細胞-卵子復合物(COC)脂質存在狀態(tài)
　　 目的：系統(tǒng)性描述生理狀態(tài)下圍排卵期小鼠卵巢組織中的脂質存在狀態(tài)；COC內脂滴相關蛋白表達；COC內脂滴含量動態(tài)變化及脂質代謝相關基因表達差異。
　　 內容與方法：
　　 1.免疫組織化學方法檢測圍排卵期卵巢組織中載脂蛋白Apo—A1及Apo—B,定性細胞外脂質存在狀態(tài)；
　　 2.免疫熒光染色共定位載脂蛋白Apo—B與卵丘顆粒細

2、胞骨架蛋白-透明質酸酶結合蛋白(HABP),定位細胞外脂質分布；
　　 3.使用兩類親脂性染料-BODIPY及Nile Red,定性及半定量測定COC內脂質含量及分布動態(tài)變化；
　　 4.免疫組織化學檢測PAT及CIDE兩大類脂質相關蛋白家族成員在卵巢組織中表達；
　　 5.免疫熒光共定位ADRP及脂滴在COC中表達,半定量COC內ADRP蛋白表達,Realtime-PCR測定COC內ADRP基因表達；
　

3、　 6.Taqman Array96一well plate IP/N4415461)檢測小鼠未成熟及成熟COC內脂質代謝相關基因表達(44個)。
　　 結果：
　　 1.Apo—A1及Apo—B在小鼠卵巢組織中的免疫組織化學染色揭示在排卵周期中脂蛋白存在于卵子及其周圍顆粒細胞中。在排卵hCG刺激之前低水平表達,而排卵刺激6h之后在卵泡竇腔內表達大量的增加,接近排卵時(hCG后12h)達到最高峰值。排卵之后仍可在輸卵管內

4、檢測到載脂蛋白包裹在卵子周圍；
　　 2.Apo-B在卵泡竇腔內持續(xù)表達,hCG刺激后呈現(xiàn)增加趨勢；HABP在排卵hCG刺激后出現(xiàn)。Apo—B與HABP表達共定位表明載脂蛋白錨定于卵丘顆粒細胞骨架蛋白之上,為卵丘顆粒細胞的生長、擴張、植入過程提供脂質能量來源,進而為卵子的成熟、受精、卵裂提供能量成為可能；
　　 3.兩類特異性親脂熒光染料對小鼠圍排卵期COC內脂滴表達進行定位,半定量分析表明兩種染色結果類似。脂滴存在于排

5、卵前后的小鼠卵子以及卵丘顆粒細胞的胞漿內。脂滴在未成熟的小鼠卵子內均勻分布,而在hCG峰后,脂滴轉化成為大的塊狀顆粒,聚集于卵胞漿內。脂滴的半定量分析得出,排卵峰出現(xiàn)后小鼠卵子體積縮小脂滴重新分布,呈團塊狀聚集于胞漿內,脂質含量增加；
　　 4.免疫組織化學檢測PAT及CIDE兩大類脂質相關蛋白家族表達。在整個圍排卵期的卵巢組織內,ADRP廣泛分布于卵泡膜細胞、壁層顆粒細胞、卵丘顆粒細胞,以及分布于從次級卵泡至竇腔卵泡之間的所有

6、卵子內。hCG刺激之前,ADRP均質分布于卵子內,隨著排卵峰值出現(xiàn),ADRP聚集呈點狀,散在分布。Perilipin在卵泡膜細胞中持續(xù)高表達,在卵泡壁層顆粒細胞及COC中的表達相對較低,排卵峰值的刺激對其表達量無明顯影響。CIDE-A及CIDE-B均表達于卵巢組織內,在較小的次級卵泡中表達量較高,隨著卵泡生長,其表達量呈現(xiàn)下降趨勢；
　　 5.ADRP與BODIPY在COC內呈現(xiàn)共定位表達,而且與光鏡下卵子內脂滴黑色顆粒位置一致

7、。表明ADRP即為COC內的脂滴包裹蛋白。ADRP蛋白及mRNA表達在排卵后均顯著增加；
　　 6.所檢小鼠COC測脂質代謝相關基因共44個。在成熟過程中36個脂類代謝途徑中的關鍵酶基因表達發(fā)生顯著變化。由于成熟后小鼠COC較未成熟COC內含有顯著增加的細胞內脂滴含量,因此甘油三酯、膽固醇、脂肪酸等合成關鍵酶類的基因表達降低,細胞攝取受體減少,線粒體酶活性降低,而磷脂分解代謝增強,其下游產物如各類前列腺素、血栓烷A類、白介素及炎

8、癥性細胞因子等合成基因表達增強。而已有研究表明這些炎癥介質對于正常的卵子成熟及排卵過程具有重要作用。PPARgamma基因作為細胞內脂質代謝調控基因,在小鼠COC中也起到重要的作用,所檢測的44個基因多數(shù)已證明為PPAR調控基因,由此而得出假設:PPARgamma可能是小鼠COC內各類脂質代謝的總調控者,在小鼠COC成熟過程中綜合調控各類基因表達以使COC具有充足的甘油三酯為COC排卵及后續(xù)受精提供能量儲備,多量的磷脂提供受精后的卵裂過

9、程所需的細胞膜,同時磷脂的各類代謝產物也是正常卵子發(fā)育及排卵過程的保障,而多量的游離膽固醇則是各種類固醇激素合成的前體物質。
　　 結論：
　　 1.載脂蛋白Apo—A1以及Apo—B均表達于小鼠圍排卵期卵巢組織內,結合于卵丘顆粒細胞結構蛋白,包裹在卵子周圍,其表達量在靠近排卵時尤為增高,是卵子生長過程細胞外脂質供應來源；
　　 2.小鼠圍排卵期卵子及顆粒細胞中存在著細胞內脂滴儲備。脂滴呈均質分布于卵胞漿內,而在

10、排卵峰出現(xiàn)后,伴隨著GVBD以及第一極體的排出,胞漿結構重塑,脂滴分布模式發(fā)生動態(tài)變化,大量的脂滴形成大顆粒狀,聚集于卵子中央,同時伴隨卵子體積縮?。?br>　　 3.ADRP蛋白在圍排卵期卵巢組織中的表達呈現(xiàn)動態(tài)變化,在未成熟卵子內呈均質表達,逐漸變成為成熟卵子中點狀聚集,散在分布。成熟COC內ADRP蛋白及mRNA表達量增加。ADRP是COC內包裹脂滴的調節(jié)蛋白。Perilipin在卵泡膜細胞中特異高表達,推斷其在卵巢組織中的作用

11、類似于在其他類固醇激素分泌的細胞(如腎上腺皮質,leydig細胞等),調節(jié)卵巢組織內類固醇激素類的合成、分泌。CIDE家族的表達隨著卵泡發(fā)育周期表達量降低,其中的作用機制尚不明確；
　　 4.脂質代謝調節(jié)相關基因差異表達揭示,PPARgamma作為小鼠COC內脂類代謝總調控基因,促使COC在成熟過程中大量儲集甘油三酯、游離膽固醇及脂肪酸。為排卵、受精及卵裂過程及類固醇激素合成提供重要的能量來源及合成前體。各種脂類的攝取、合成、代

12、謝及釋放通路相互配合協(xié)調,呈動態(tài)平衡狀態(tài)。
　　 第二章:高脂飲食對小鼠圍排卵期卵丘顆粒細胞-卵子復合物脂質代謝及細胞器功能影響
　　 目的：揭示高脂飲食對小鼠圍排卵期COC內脂質含量及脂質相關蛋白表達影響；明確增加的脂肪含量所誘導的細胞脂毒性反應(線粒體內膜電位,內質網(wǎng)應激,細胞凋亡)的發(fā)生；檢測高脂飲食對COC內脂質代謝相關基因表達影響。
　　 內容與方法：
　　 1.肥胖小鼠模型建立:5周齡CBA小

13、鼠以21％脂肪的高脂飲食(High Fat Diet,HFD)或對照飲食(control Diet,CD)飼養(yǎng)4周。稱量體重,取血清檢測血糖、胰島素、甘油三酯及膽固醇水平；
　　 2.特異性親脂性染料BODIPY對飲食干預后HFD組和CD組COC內脂質含量半定量分析；
　　 3.免疫組織化學檢測HFD組與CD組卵巢組織內ADRP表達量,Real—time PCR檢測該基因表達狀況；
　　 4.HFD組及CD組CO

14、C內線粒體內膜電位JC-1染色；
　　 5.Real-time PCR檢測兩組COC及壁層顆粒細胞中內質網(wǎng)應激基因(GRP78,ATF4以及CHOP10)表達；
　　 6.壁層顆粒細胞DNA碎片ladder,180bp及360bp條帶強度半定量；
　　 7.卵巢組織TUNEL染色,凋亡細胞計數(shù)計算凋亡指數(shù);
　　 8.Taqman Array96-well plate(P/N4415461)檢測高脂飲食組

15、與對照飲食組小鼠成熟COC內脂質代謝相關基因表達差異(44個)。
　　 結果：
　　 1.4周高脂飲食后小鼠體重增加2g,血清學檢測表明小鼠具有高脂蛋白血癥及高血糖癥;
　　 2.4周飲食干預后,HFD組未成熟卵子內脂肪含量較CD組明顯增加,而hOG刺激之后的脂肪含量出現(xiàn)更進一步的顯著增加(P<0.0001)。飲食干預直接增加卵巢內生長發(fā)育成熟過程中的卵子內脂肪含量,卵子體積增大(P=0.045)；
　　

16、 3.COC中JC-1染色測定線粒體內膜電位,明確了HFD對小鼠卵子胞漿內線粒體損傷作用。在對照組卵子中,高膜電位線粒體出現(xiàn)在卵泡漿周邊區(qū)域(紅色),而較低電位的線粒體分布于卵泡漿中央?yún)^(qū)域(綠色)。在高脂飲食小鼠卵子中,周邊區(qū)域的紅色熒光強度減弱,較廣泛地分布于卵泡漿內。而綠色熒光呈現(xiàn)增加趨勢聚集于卵胞漿內(線粒體損傷最早即表現(xiàn)為線粒體膜極性下降,紅色及綠色熒光比例代表細胞內的膜極性狀態(tài),該比值的減少是線粒體損傷的標志)。對照組未成熟小

17、鼠卵子JC-1染色后紅/綠熒光強度比值為0.82±0.04,成熟后比值降低為0.61±0.06(P=0.01)。高脂飼料喂養(yǎng)四周后,成熟及未成熟卵子紅色/綠色熒光比值均減少,未成熟卵子比值為0.59±0.05(P=0.002),成熟卵子比值為0.38±0.05(P=0.01)；
　　 4.為了明確高脂飲食對小鼠卵子胞漿中內質網(wǎng)功能的影響,分別測定了COC以及壁層顆粒細胞中內質網(wǎng)應激基因的表達量,包括GRP78、ATF4以及CHO

18、P10。(GRP78是最常用的內質網(wǎng)應激的生物學標志；ATF4蛋白是一種轉錄因子,調節(jié)unfolded protein response反應中數(shù)種基因的啟動子；cHOP10是另外一種ER應激的反應蛋白)。實驗發(fā)現(xiàn)高脂飲食促使小鼠COC中GRP78和ATF4基因表達增加,顆粒細胞的GRP78表達也增加。CHOP10表達量未受到飲食干預影響,在兩組中的表達量相當；
　　 5.檢測小鼠卵巢組織中顆粒細胞及COC內的細胞凋亡狀態(tài)。DNA

19、 ladder分析顯示顆粒細胞內180bp及360bp細胞條帶強度較對照組增加,表明DNA破碎程度增加。卵巢組織切片TUNEL染色顯示HFD卵巢組織中顯著增加的TUNEL陽性染色細胞。HFD組凋亡指數(shù)在COC中為44.03‰,壁層顆粒細胞中為31.83‰；正常飲食小鼠COC中凋亡指數(shù)為7.6‰,壁層顆粒細胞中為7.65‰(P<0.001)；
　　 6.脂類代謝相關基因檢測表明,高脂飲食在多方面影響COC內脂質代謝。包括長鏈不飽和

20、脂肪酸生成、膽固醇生成、磷脂代謝、白介素、細胞因子生成以及線粒體代謝酶類。這些異常的代謝途徑均可能是進一步影響卵子質量的關鍵因素。
　　 結論：
　　 1.使用4周HFD方法建立小鼠肥胖模型,小鼠體重顯著增加2g(P<0.01)。各項脂類代謝內分泌指標表明小鼠出現(xiàn)高脂血癥傾向,類似于肥胖人群,肥胖模型建立成功；
　　 2.4周HFD可顯著促進小鼠未成熟及成熟COC內脂滴募集,脂肪含量增加；
　　 3.4周

21、HFD促使小鼠卵子內線粒體膜電位降低,顯示小鼠卵子線粒體損傷；
　　 4.HFD可促使小鼠COC及壁層顆粒細胞內ER stress基因表達增強；
　　 5.脂類囤積,ERstress,線粒體損傷等脂毒性反應可最終導致細胞DNA碎裂,加劇HFD小鼠COC細胞凋亡過程；
　　 6.HFD顯著影響COC內正常脂質代謝基因的平衡狀態(tài),由此可最終影響卵子質量。
　　 第三章異常的內分泌環(huán)境對體外培養(yǎng)未成熟小鼠卵子脂

22、質代謝影響
　　 目的：評估兩類最常用的體外培養(yǎng)體系對小鼠卵子體外成熟過程脂類募集影響；肥胖患者卵泡液,正常體重患者卵泡液對小鼠體外成熟COC脂肪含量脂蛋白基因表達及內質網(wǎng)應激基因表達影響；模擬異常內分泌的體外培養(yǎng)環(huán)境(高胰島素,高雄激素,不同長度碳鏈脂肪酸)對體外成熟小鼠卵子內脂肪含量影響。
　　 內容與方法：
　　 1.采用最常用的體外培養(yǎng)成熟系統(tǒng):基于3mg/ml無自由脂肪酸的牛血清白蛋白(Bovine s

23、erum albumin,BSA)或基于5％胎牛血清(Fetal calf serum,FCS),體外成熟COC行脂肪染色及卵子成熟度評估；
　　 2.50％體積比添加人類卵泡液用于小鼠COC體外培養(yǎng)成熟。行脂肪染色及卵子成熟度評估:Real—time PCR用于半定量COC內ADRP及ER應激基因表達；luminax檢測卵泡液中載脂蛋白及慢性炎癥因子水平；
　　 3.小鼠未成熟卵子體外培養(yǎng):胰島素濃度梯度0μg/ml,

24、0.052μg/ml,0.26μg/ml,1.3μg/ml,6.9μg/ml。睪酮濃度梯度0nmol/L,200nmol/L,1000nmol/L、及5000nmol/L。各類脂肪酸濃度50nmol/L。行脂肪染色及卵子成熟度評估。
　　 結果：
　　 1.體外培養(yǎng)成熟系統(tǒng)中添加生長因子(EGF及FSH)可顯著促進COC內脂滴募集,5％FCS培養(yǎng)環(huán)境可進一步促進COC脂滴含量增加。BSA內培養(yǎng)成熟卵子內脂肪含量與在體成熟

25、卵子水平一致,差異無統(tǒng)計學意義；
　　 2.雖然肥胖患者及對照患者卵泡液均未影響小鼠COC的卵丘顆粒細胞擴張,但肥胖組卵泡液含有顯著增加的炎癥性細胞因子IL-6,IL-10,Leptin及載脂蛋白AⅠ,AⅡ,可顯著增加卵子內脂肪含量,阻斷小鼠卵子第一極體排出過程,卵子成熟率明顯降低,同時伴有COC內ER應激基因表達增強。正常患者卵泡液作為小鼠COC體外培養(yǎng)環(huán)境,對COC內脂滴含量及ADRP基因表達影響與在體成熟COC一致;

26、>　　 3.胰島素:依據(jù)生理狀態(tài)下卵泡液內胰島素濃度水平制定濃度梯度,體外培養(yǎng)添加外源性的胰島素并未影響COC擴張或卵子第一極體排出過程,COC內脂肪含量測定亦未發(fā)現(xiàn)各濃度對于卵子內脂肪含量影響；睪酮:濃度大于1000nmol/L睪酮明顯阻礙卵子生殖泡降解過程及第一極體排出,卵丘顆粒細胞擴張程度受抑制,卵子成熟過程受到阻礙導致該組卵子內脂肪含量相應減少；不同長度碳鏈脂肪酸:實驗選用碳鏈長度介于8至18的飽和脂肪酸,以及C18單不飽和脂

27、肪酸。用于比較不同長度碳鏈脂肪酸及脂肪酸飽和程度對于卵子內脂肪含量影響。結果表明卵子對于不同碳鏈長度脂肪酸的攝取具有選擇性。長度為16碳的Palmitic較其他脂肪酸更顯著性促進卵子內的脂滴募集,不飽和脂肪酸并未明顯增加卵子內脂滴含量。
　　 結論：
　　 1.比較BSA及FCS兩類最常用的體外培養(yǎng)成熟系統(tǒng)對于維持小鼠卵子正常脂肪動態(tài)變化方面的優(yōu)劣,BSA內成熟卵子內脂滴含量與在體成熟卵子較一致,而FCS則顯著促進了卵子

28、內脂滴的募集過程；
　　 2.患者卵泡液內甘油三酯(TG),脂肪酸(FFA)及亞急性炎癥因子水平為機體內分泌環(huán)境的直接反映。肥胖患者卵泡液內顯著增加的TG,FFA,載脂蛋白A及炎癥細胞因子(IL-6,IL-10及l(fā)eptin)可顯著抑制體外培養(yǎng)成熟的小鼠卵子第一極體排出,影響卵子成熟；同時卵子內脂肪含量及ADRP表達顯著增加伴有ER應激基因的表達增強；
　　 3.外源性添加胰島素未發(fā)現(xiàn)對小鼠卵子內脂肪含量影響；濃度大于1