含重組人表皮生長因子（rh-EGF）新型水凝膠的構(gòu)建及其對糖尿病鼠傷口愈合的影響和機理探討.pdf

1、研究目的: 1．觀察rh—EGF在水凝膠基質(zhì)中的釋放模式。 2．檢測rh—EGF在水凝膠基質(zhì)中釋放后的生物活性。 3．探討含rh—EGF水凝膠對糖尿病大鼠傷口愈合的影響及可能的作用機理。 材料與方法: 1.構(gòu)建含rh-EGF的水凝膠原料：rh-EGF、聚乙烯醇、海藻酸鈉、甘油、苯甲酸鈉、硼酸鈉、氯化鈣。合成技術(shù)：原位交聯(lián)。物理性能檢測：由合作單位中山大學高分子研究所完成。毒理實驗：實驗組其他成員完

2、成。 2.rh-EGF在水凝膠基質(zhì)中的釋放模式及穩(wěn)定性觀察 3.rh-EGF在水凝膠基質(zhì)中釋放后的活性檢測(細胞增殖MTT法)分別取上述實驗2中1 d、7 d、14 d各12個時間點釋放液0.4 ml加入3.6 ml含10﹪小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中(含rh-EGFl～10 ng/ml)，用0.22 um濾器過濾后備用。各取200μl檢測液加入已接種Balb/c3T3細胞的96孔板中，同時設陽性對照組(培養(yǎng)基中含rh-E

3、GF標準品1～64 ng/ml，分別為1 ng/ml、4 ng/ml、16 ng/ml、64 ng/ml，每個濃度設3孔)和陰性對照組(培養(yǎng)基中不含rh-EGF)各12孔。于37℃5﹪CO<,2>環(huán)境下培養(yǎng)48小時。MTT法于492 nm波長處檢測活性(用吸光度表示)。 4.建立糖尿病大鼠皮膚傷口模型56只250～300克清潔級SD大鼠，適應性飼養(yǎng)1周后，連續(xù)3 d腹腔內(nèi)注射35 mg/kg STZ誘導糖尿病，注射3 d后尾靜脈

4、采血檢測隨機血糖水平，注射后隨機血糖水平≥16.7 mmol/L，視為糖尿病模型建立成功。糖尿病大鼠實驗期間自由進食、飲水，每周監(jiān)測體重和血糖，根據(jù)血糖水平皮下注射低精蛋白胰島素(NPH)1-2 U/d，血糖維持在16.7 mmol/L～28 mmol/L。 5.實驗動物分組與創(chuàng)面用藥實驗動物按創(chuàng)面處理因素的不同分4大組，每組按不同處理時間再分為7天組和14天組(見表1)?？瞻讓φ战M：不予處理；水凝膠基質(zhì)組：每天外用水凝膠基質(zhì)0

5、.5g/每個創(chuàng)面；rh-EGF水凝膠組：每天外用rh-EGF水凝膠0.5 g/每個創(chuàng)面(含rh-EGF5μg)；rh-EGF水溶液組：每天外用rh-EGF水溶液0.5 ml/每個創(chuàng)面(含rh-EGF5μg)。 6.傷口愈合率評價分別在傷口形成后0 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d用數(shù)碼相機進行傷口拍攝(A610，Canon)，同時放置一個有刻度直尺并標明大鼠的號碼。傷口面積用Image J(1.36b版本)進行計算

6、。 7.皮膚組織HE(Haematoxylin and eosin)染色及組織學評分組織取材后，經(jīng)4﹪的多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，行與頭尾軸和皮膚表面垂直厚度4μm切片，切片經(jīng)二甲苯脫蠟，然后進行濃度下行的梯度酒精直至蒸餾水。蘇木素-伊紅染色，自來水沖洗。常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固。組織切片HE染色后，顯微鏡下觀察以下指標并進行組織學評分：表皮和真皮的再生、肉芽組織厚度、新生血管形成，由一位病理科醫(yī)生獨立進行組織學評分

7、。 8.皮膚組織中增殖細胞核抗原(PCNA)免疫組織化學檢測采用SABC法染色。切片常規(guī)脫蠟水化后，加入過氧化酶阻斷溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，抗原修復后滴加5﹪BSA封閉非特異性反應，加入小鼠抗大鼠PCNA的第一抗體，4℃冰箱過夜(陰性對照用PBS替代一抗)后加入生物素標記的第二抗體，室溫下孵育后再加入鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，DAB顯色，脫水、透明、封片。染色過程中均設有陰性對照。免疫組化染色結(jié)果按照IRS標準

8、進行評分。 9.皮膚組織中抗凋亡蛋白(BCL-2)免疫組織化學檢測采用SABC法染色。切片常規(guī)脫蠟水化后，加入過氧化酶阻斷溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，抗原修復后滴加5﹪BSA封閉非特異性反應，加入兔抗大鼠BCL-2的第一抗體，4℃冰箱過夜(陰性對照用PBS替代一抗)后加入生物素標記的第二抗體，室溫下孵育后再加入鏈霉菌抗生物素蛋白.過氧化物酶溶液，DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片。染色過程中均設有陰性對照。免疫組化染色

9、結(jié)果按照IRS標準進行評分。 10.皮膚組織中表皮生長因子受體(EGFR)蛋白質(zhì)水平的Western blot檢測提取皮膚組織中總蛋白質(zhì)，用MiniBCA法測定蛋白濃度，再通過蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)來測定EGFR的蛋白質(zhì)水平，以β-actin作為內(nèi)參照。在暗室中用X光膠片曝光。用BandScan4.3軟件對條帶進行灰度掃描，以總灰度代表EGFR蛋白的表達量，以目的蛋白與β-actin的比值代表目的蛋白相對水平。

10、 11.統(tǒng)計學分析實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料符合正態(tài)分布者用均數(shù)±標準差表示，重復測量資料多組間比較采用多元方差分析，非重復測量資料多組間比較采用單因素方差分析，非正態(tài)數(shù)據(jù)采用Wilcoxon秩和檢驗，檢驗水平α值定為0.05. 實驗結(jié)果: 1.rh-EGF在水凝膠基質(zhì)中的釋放模式及穩(wěn)定性觀察試驗期間，rh-EGF水凝膠在不同溫度、不同儲存時間下外觀、性質(zhì)、氣味、pH值均無明顯變化。

11、 2.rh-EGF在水凝膠基質(zhì)中釋放后的活性檢測:實驗組、陽性對照組、陰性對照組的平均活性(吸光度)分別為0.90±0.10、0.86±0.10、0.80±0.14、0.87±0.15、0.55±0.10。實驗組和陽性對照組促BALB/c3T3增殖的活性均高于陰性對照組(p<0.05)，實驗組和陽性對照組間差異無統(tǒng)計學意義。 3.糖尿病大鼠傷口模型的建立SD大鼠腹腔注射STZ 3 d后，各個時間點隨機血糖均高于16.7

12、mmol/L，范圍波動于17～28 mmol/L。成模后體重均明顯下降。從血糖和體重隨時間變化的趨勢看，空白對照組、水凝膠基質(zhì)組、含rh-EGF水凝膠組、含rh-EGF水溶液組4組組間血糖值、體重值差異無統(tǒng)計學意義。實驗期間血糖和體重對傷口愈合的影響在各組間取得均衡。 4.傷口愈合率比較從傷口愈合率隨時間變化的趨勢看，4組愈合率的差別具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。含rh-EGF水凝膠組在各個時間點愈合率均最高。傷口形成后第3

13、d、5 d水凝膠處理組(B、C)愈合率高于空白對照組(p<0.05)；第10 d水凝膠處理組(B、C)優(yōu)于非水凝膠處理組(A、D)(p<0.05)；第14 d三個治療組均優(yōu)于空白對照組(p<0.05)，而三個治療組間差異無統(tǒng)計學意義。 5.4組傷口組織病理學比較在新生血管形成評分中，傷口形成后第7 d rh-EGF處理組(C、D)高于非rh-EGF處理組(A、B)(p<0.05)，提示rh-EGF具有促進新生血管形成的作用。在再

14、上皮化評分中，水凝膠處理組(B、C)高于非水凝膠處理組(A、D)，14 d時趨勢明顯(p<0.05)，提示水凝膠基質(zhì)可促進再上皮化。在上述評分中，rh-EGF 水凝膠組評分最高，提示rh-EGF和水凝膠基質(zhì)協(xié)同加速新生血管形成和再上皮化。肉芽組織厚度評分中，傷口形成后第7 d時rh-EGF水凝膠組略高于其它三組，組間差異暫未達到統(tǒng)計學意義。 6.不同時間4組PCNA蛋白表達水平的比較PCNA蛋白主要在增生活躍的表皮細胞、毛囊上皮

15、、血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞的胞核表達，表達水平7 d>14 d>0 d。從其隨時間變化的趨勢看，各組問的區(qū)別具有統(tǒng)計學意義。0d時空白對照組、水凝膠基質(zhì)組、含rh-EGF水凝膠組、含rh-EGF水溶液組組問差異無統(tǒng)計學意義。傷口形成后第7 d各組表達水平分別為9.69±0.93、10.80±1.25、11.49±1.12、10.71±1.27：rh-EGF水凝膠組高于空白對照組(p<0.05)。第14 d各組間差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)果提示

16、rh-EGF水凝膠在傷口愈合的早中期促進細胞增殖。 7.結(jié)果提示rh-EGF在傷口愈合的早中期可能具有上調(diào)BCL-2蛋白表達的作用，rh-EGF水凝膠可能對凋亡途徑產(chǎn)生一定的影響，從而影響傷口愈合。 8.不同時間4組間EGFR蛋白表達水平的比較從EGFR蛋白表達水平隨時間變化的趨勢看，結(jié)果提示rh-EGF在傷口愈合的早中期具有上調(diào)EGFR蛋白表達作用。EGFR蛋白表達水平的變化規(guī)律與PCNA、BCL-2的變化規(guī)律相近，提

17、示EGFR在傷口愈合過程中可能同時參與細胞增殖和細胞凋亡的調(diào)節(jié)。 結(jié)論: 1.本研究構(gòu)建的含rh-EGF水凝膠具有儲存穩(wěn)定性。水凝膠基質(zhì)對rh-EGF有緩釋和保持生物活性作用。 2.水凝膠基質(zhì)、含rh-EGF的水凝膠能促進糖尿病大鼠傷口愈合。 3.含rh-EGF的水凝膠促進傷口愈合的可能機制為：水凝膠基質(zhì)保護創(chuàng)面、促進再上皮化；rh-EGF在傷口形成后的早中期上調(diào)內(nèi)源性EGFR表達，促進細胞增殖、遷移、分