表皮生長(zhǎng)因子(EGF)與大腸癌關(guān)系的研究.pdf

1、目的:研究表皮生長(zhǎng)因子(EGF)在臨床大腸癌組織中表達(dá)及意義;探討EGF基因多態(tài)性與大腸癌發(fā)病的相關(guān)性;揭示抑制EGF基因表達(dá)對(duì)大腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖作用及機(jī)制。
　　 方法:通過(guò)免疫組化的方法檢測(cè)分析臨床大腸癌病理標(biāo)本中EGF的表達(dá)。選取50名大腸癌患者病理組織標(biāo)本，結(jié)腸癌31例，直腸癌19例。高分化腺癌為12例，中分化腺癌為29例，低分化腺癌為9例。依據(jù)TNM分期分類(lèi)，Ⅰ期9例，Ⅱ期16例，Ⅲ期17例，Ⅳ期8例。對(duì)照組選取標(biāo)本

2、邊緣正常大腸組織。所有標(biāo)本切片后采用免疫組化方法染色，細(xì)胞漿和/或細(xì)胞膜如果呈現(xiàn)棕黃色染色顆粒則設(shè)定細(xì)胞EGF染色陽(yáng)性。每張切片均有兩位病理醫(yī)師觀察，采用雙盲法，每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)視野用400倍顯微鏡觀察。積分分級(jí)法記錄染色結(jié)果。染色強(qiáng)度:染色無(wú)色0分，染色淺黃色評(píng)定為1分，染色棕黃色評(píng)定為2分，染色棕褐色評(píng)定為3分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù):無(wú)陽(yáng)性染色細(xì)胞評(píng)定為0分，陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)25％評(píng)定為1分，陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)26-50％評(píng)定為2分，陽(yáng)性染色

3、細(xì)胞數(shù)51-75％評(píng)定為3分，陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)＞75％評(píng)定為4分。染色積分為上述兩項(xiàng)之和，標(biāo)本染色分級(jí)如下:（一）為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)0分，（±）為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)2-3分，(+)為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)4-5分，(++)為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)6-7分，其中染色陽(yáng)性為(+)和(++)的標(biāo)本。驗(yàn)證其表達(dá)情況。同時(shí)，對(duì)大腸癌組織中EGF表達(dá)情況與臨床指標(biāo)關(guān)系進(jìn)行研究，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組間對(duì)比應(yīng)用x2檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 利用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)

4、度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)研究EGF基因多態(tài)性。檢驗(yàn)180名大腸癌患者EGF基因型，病例組年齡區(qū)間為35-84歲，平均年齡60.8歲，其中女性患者85名，男性患者95名。對(duì)照組年齡區(qū)間為55-65歲，平均年齡61歲，其中女性患者87名，研究EGF+61GG基因型與大腸癌的關(guān)系。所有病人抽靜脈血，提取DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，使用限制性內(nèi)切酶AluI酶切，將酶切后產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，統(tǒng)計(jì)患者EGF+61位點(diǎn)基因型，研究所有大腸癌患者

5、EGF+61基因多態(tài)性分布狀況。
　　 利用RNAi技術(shù)探討EGF的缺失對(duì)大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響。查詢EGFmRNA核苷酸序列，通過(guò)軟件設(shè)計(jì)針對(duì)EGF的siRNA，通過(guò)化學(xué)合成的方法合成三條GF-siRNA，通過(guò)Lipofectamine 2000質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)好的SW620大腸癌細(xì)胞中，利用羧基熒光素（FAM）檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，再通過(guò)RT-PCR研究EGF-siRNA對(duì)SW620大腸癌細(xì)胞EGF基因表達(dá)的影響，提取轉(zhuǎn)染后的大腸癌

6、細(xì)胞中RNA，通過(guò)SuperScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶作用轉(zhuǎn)換成DNA，將所得的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并電泳，選擇沉默EGF基因效果最好的EGF-siRNA，采用MTT法研究SW620大腸癌細(xì)胞EGF基因受到干擾后，細(xì)胞生長(zhǎng)受抑的情況，在一定數(shù)量的細(xì)胞中，產(chǎn)生的藍(lán)紫色針狀結(jié)晶與細(xì)胞的數(shù)量幾乎成正比。因此，MTT試驗(yàn)測(cè)得的OD值與細(xì)胞數(shù)成正比?？梢酝ㄟ^(guò)吸光值來(lái)計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量。mRNA受到抑制可導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)減緩。，通過(guò)吸光值可以間接計(jì)算細(xì)胞生

7、長(zhǎng)抑制率=（1一實(shí)驗(yàn)組A490nm/對(duì)照組A490nm）×100％，并根據(jù)結(jié)果繪制生長(zhǎng)曲線。不同處理組細(xì)胞經(jīng)48小時(shí)培養(yǎng)后，常規(guī)消化收集細(xì)胞，Annexin V和PI染液室溫共孵育30min，流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，CellQuest軟件分析熒光強(qiáng)度。
　　 結(jié)果:表皮生長(zhǎng)因子(EGF)在臨床大腸癌組織中呈高表達(dá)，并與大腸癌組織分化、分期及轉(zhuǎn)移存在關(guān)聯(lián)性。EGF在大腸癌細(xì)胞中表達(dá)主要集中于細(xì)胞的細(xì)胞漿和（或）細(xì)胞核中，EGF染色表現(xiàn)為黃

8、色的片狀染色區(qū)域。所檢測(cè)的50例大腸癌患者的腫瘤組織中有27例EGF染色陽(yáng)性(54.00％);50例對(duì)照組癌旁粘膜中僅有5例EGF染色陽(yáng)性(10.00％)。數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后如下:EGF在大腸癌腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯強(qiáng)于其在癌旁粘膜細(xì)胞中的表達(dá)（P＜0.05）。EGF在腫瘤組織中的表達(dá)與腫瘤的分化程度存在關(guān)聯(lián)，實(shí)驗(yàn)中男患者EGF染色陽(yáng)性率為57％，女患者EGF染色陽(yáng)性率為53％;年齡50歲以上的（包括50歲）患者EGF染色陽(yáng)性率為54

9、.84％，50歲以上的患者EGF染色陽(yáng)性率為56.25％;這些分類(lèi)方法中各組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。以TNM分期分組，Ⅰ期為33.33％、Ⅱ期為43.75％、Ⅲ期為58.82％、Ⅳ期為75％，但是將Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ、Ⅳ比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）;EGF染色陽(yáng)性率與腫瘤分化有相關(guān)性，根據(jù)分化程度分類(lèi)，高分化組為25％、中分化組為62.07％、低分化組為77.78％，其中EGF染色陽(yáng)性率在高分化組與中分化兩組之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差

10、異(P＜0.05)，而在中分化組與低分化兩組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　 通過(guò)PCR-RFLP方法，發(fā)現(xiàn)EGF+61GG基因型與大腸癌發(fā)病存在相關(guān)性。大腸癌患者EGF+61GG基因型顯著高于對(duì)照組(OR=1.93，95％可信區(qū)間(CI)=1.07，3.50; p=0.03)，EGF+61GG基因型的中國(guó)人群患大腸癌的幾率比EGF+61AG或EGF+61AA的人群高，通過(guò)分層分析大腸癌患者腫瘤部位、大小、生長(zhǎng)形態(tài)、

11、分化、TNM分期等大腸癌臨床指標(biāo)與EGF+61無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。
　　 選用大腸癌SW620細(xì)胞作為EGF表達(dá)強(qiáng)度與大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖相關(guān)性研究的體外細(xì)胞模型，利用EGF-siRNA干擾或下調(diào)EGF，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在EGF-siRNA3轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞后，與對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組相比較，在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)至96小時(shí)，觀察到EGF-siRNA3組細(xì)胞數(shù)量的明顯減少，此結(jié)果證實(shí)EGF-siRNA可以明顯抑制SW620細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，且EG

12、F-siRNA在轉(zhuǎn)染后48細(xì)胞開(kāi)始發(fā)揮生長(zhǎng)增殖抑制的作用并可延長(zhǎng)至轉(zhuǎn)染后96小時(shí)。另外，在96小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)上，EGF-siRNA的轉(zhuǎn)染增強(qiáng)SW620細(xì)胞增殖抑制。應(yīng)用Annexin V與PI雙染色結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞和對(duì)照組/轉(zhuǎn)染組比較，Annexin V+PI-百分比明顯增高，此結(jié)果提示EGF-siRNA3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，即下調(diào)或干擾EGF抑制SW620細(xì)胞增殖的重要機(jī)制為凋亡誘導(dǎo)。
　　 結(jié)論:EGF的表達(dá)與大腸癌的發(fā)生發(fā)展呈