腎上腺受體β1亞型(ADRB1)在腫瘤惡病質(zhì)脂肪消耗過程中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、第一部分脂肪分解通路受體在腫瘤惡病質(zhì)病人脂肪組織中的表達(dá)及臨床意義
　　目的：檢測腫瘤惡病質(zhì)病人和對(duì)照組病人脂肪細(xì)胞膜上脂肪分解通路受體的表達(dá)情況，分析其與腫瘤惡病質(zhì)病人脂肪分解增強(qiáng)的關(guān)系。
　　方法：共入組34例病人，其中腫瘤惡病質(zhì)12例、腫瘤對(duì)照13例、良性對(duì)照9例，術(shù)中收集腹部皮下脂肪組織標(biāo)本。Real-time PCR方法檢測腎上腺素受體β1亞型(ADRB1)、。腎上腺素受體β2亞型(ADRB2)、腎上腺素受體β3亞

2、型(ADRB3)、腎上腺素受體α2C亞型(ADRA2C)、心房鈉尿肽受體A(NPRA)、胰島素受體(INSR)，以及激素敏感性酯酶(HSL)的mRNA水平。Western blot測定ADRB1和HSL的蛋白水平；免疫組織熒光方法進(jìn)行ADRB1蛋白定位。
　　結(jié)果：腫瘤惡病質(zhì)病人脂肪組織中ADRB1和HSL的mRNA相對(duì)水平比腫瘤對(duì)照組和良性對(duì)照組升高約50％(P=0.022；P=0.013)，而其他脂肪分解通路受體的mRNA相對(duì)

3、水平?jīng)]有顯著改變。惡病質(zhì)組ADRB1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別是腫瘤對(duì)照組的1.5倍及良性對(duì)照組的3倍(P<0.001；P<0.001)。免疫組織熒光檢測證實(shí)ADRB1蛋白表達(dá)于脂肪細(xì)胞膜。惡病質(zhì)組HSL蛋白表達(dá)量是兩個(gè)對(duì)照組的2～2.5倍(P<0.001；P=0.005)。ADRB1和HSL的蛋白相對(duì)表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.474，P=0.005)。ADRB1蛋白相對(duì)表達(dá)水平與甘油三酯(triglyceride，TG)分解率呈正相關(guān)(r=0

4、.406，P=0.002；r=0.435，P=0.01)。
　　結(jié)論：腫瘤惡病質(zhì)病人脂肪細(xì)胞膜上ADRB1蛋白表達(dá)增加，與HSL表達(dá)增強(qiáng)和TG分解率增強(qiáng)呈正相關(guān)，提示ADRB1過表達(dá)可能通過激活脂肪分解通路導(dǎo)致腫瘤惡病質(zhì)病人脂肪消耗。
　　第二部分基于3T3-L1前脂肪細(xì)胞株的人類ADRB1基因穩(wěn)定過表達(dá)模型的建立
　　目的：利用慢病毒載體，建立基于3T3-L1前脂肪細(xì)胞株的人類ADRB1基因穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞模型。

5、>　　方法：利用DNA重組技術(shù)將人類ADRB1 cDNA克隆片段和慢病毒載體質(zhì)粒(pLNX-IRES-ZsGreenl)連接；將重組載體和慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝；包裝好的假病毒顆粒被分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，質(zhì)粒感染48小時(shí)收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，直接用于感染3T3-L1前脂肪細(xì)胞株，將ADRB1基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞株。最后利用GFP流式細(xì)胞分選技術(shù)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)，從而建

6、立了基于3T3-L1前脂肪細(xì)胞株的人類ADRB1基因穩(wěn)定過表達(dá)模型。
　　結(jié)果：Western blot檢測證明，ADRB1過表達(dá)組的ADRB1蛋白相對(duì)水平較轉(zhuǎn)空病毒對(duì)照組(mock組)顯著增高，證明了含有ADRB1基因的慢病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建、慢病毒包裝、慢病毒感染3T3-L1細(xì)胞、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株篩選步驟均正確。ADRB1基因隨病毒DNA整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組，使ADRB1蛋白在3T3-L1前脂肪細(xì)胞膜上穩(wěn)定過表達(dá)，基于3T3-L1前

7、脂肪細(xì)胞株的人類ADRB1基因穩(wěn)定過表達(dá)模型構(gòu)建成功。
　　結(jié)論：建立了基于3T3-Ll前脂肪細(xì)胞株的人類ADRB1基因穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞模型，使之模擬腫瘤惡病質(zhì)病人脂肪細(xì)胞的特征性改變，為進(jìn)一步研究ADRB1過表達(dá)在腫瘤惡病質(zhì)脂肪消耗過程中的作用奠定了模型基礎(chǔ)。
　　第三部分脂肪細(xì)胞中ADRB1基因過表達(dá)對(duì)脂肪消耗的影響及其分子機(jī)制
　　目的：利用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手段驗(yàn)證臨床標(biāo)本檢測實(shí)驗(yàn)所揭示的現(xiàn)象，進(jìn)一步研究ADRB1過

8、表達(dá)在腫瘤惡病質(zhì)脂肪消耗過程中的作用及其分子機(jī)制。
　　方法：設(shè)立control組、mock組、ADRB1過表達(dá)組、抑制劑干預(yù)組。利用MDI方案誘導(dǎo)ADRB1穩(wěn)定過表達(dá)的3T3-L1前脂肪細(xì)胞模型分化為成熟脂肪細(xì)胞，通過油紅O染色實(shí)驗(yàn)及Western blot檢測422(aP2)蛋白水平，研究ADRB1過表達(dá)對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響。利用Western blot方法檢測ADRB1和HSL蛋白水平，研究ADRB1過表達(dá)對(duì)TG分解通路的影

9、響；通過Western blot檢測脂肪合成通路關(guān)鍵酶脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)的蛋白水平，研究ADRB1過表達(dá)對(duì)TG合成過程的影響。
　　結(jié)果：ADRB1過表達(dá)組中ADRB1蛋白相對(duì)水平顯著高于control組和mock組，證實(shí)ADRB1過表達(dá)模型構(gòu)建成功。油紅O染色實(shí)驗(yàn)和422(aP2)蛋白水平檢測證實(shí)，control組和mock組細(xì)胞能夠分化，而ADRB1過表達(dá)組中脂肪細(xì)胞完全無法分化，該