重癥肌無力患者胸腺組織GSTm3、KPNA5基因mRNA定量檢測(cè)及蛋白表達(dá)研究.pdf

1、目的：利用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)方法定量分析KPNA5和GSTm3基因在重癥肌無力(MG)患者胸腺與正常胸腺組織中的mRNA表達(dá)水平，并利用免疫組織化學(xué)染色的方法對(duì)KPNA5蛋白在胸腺中的表達(dá)進(jìn)行組織定位，探討兩基因與重癥肌無力發(fā)病的相關(guān)性，從而對(duì)今后MG的病因研究及進(jìn)一步的生物治療奠定基礎(chǔ)。 方法： 實(shí)驗(yàn)一：首先構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-T-β-actin作為內(nèi)參，提取重組質(zhì)粒稀釋后行熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(F

2、Q-PCR)擴(kuò)增確定標(biāo)準(zhǔn)曲線，從臨床上20例重癥肌無力(MG)患者和10例先天性心臟病患者切除的胸腺組織中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成目的基因KPNA5和GSTm3的cDNA，通過熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)擴(kuò)增內(nèi)參β-actin以及KPNA5和GSTm3基因，測(cè)定β-actin基因與KPNA5和GSTm3基因的CT值，分別以每例標(biāo)本KPNA5基因與β-actin基因、GSTm3基因與β-actin基因CT值之比，作為該例標(biāo)本目的基

3、因的相對(duì)表達(dá)量。 實(shí)驗(yàn)二：30例標(biāo)本經(jīng)梯度溫度解凍至-30℃，做冰凍切片，用KPNA5抗體作為一抗，以PBS液代替一抗作陰性對(duì)照，按S-P試劑盒說明書進(jìn)行免疫組化染色，在光學(xué)顯微鏡下對(duì)KPNA5蛋白在胸腺中的表達(dá)進(jìn)行組織定位。 結(jié)果: 1.KPNA5基因在重癥肌無力患者和正常人胸腺組織中的mRNA表達(dá)水平分別為0.71±0.08和0.57±0.02，兩者之間的差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 2.

4、 GSTm3基因在重癥肌無力患者和正常人胸腺組織中的mRNA表達(dá)水平分別為0.67±0.10和0.58±0.05，兩者之間的差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 3. KPNA5蛋白在胸腺中主要表達(dá)在胸腺小體，在40倍顯微鏡下，陽性染色的胸腺小體在重癥肌無力患者和正常人胸腺組織切片中計(jì)數(shù)分別為5.88±0.69和8.99±0.49，兩者之間的差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 結(jié)論： 1.KPNA5和G