表達(dá)結(jié)核桿菌抗原85A與GM-CSF黑色素瘤細(xì)胞誘發(fā)抗鼠瘤效應(yīng)研究.pdf

1、惡性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)簡(jiǎn)稱惡黑,是目前發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一,年增長率約3％-5％。研究證明,MM與免疫的關(guān)系十分密切,相繼發(fā)現(xiàn)的大量黑素瘤相關(guān)抗原提示腫瘤具有一定的免疫原性。因而免疫治療已成為繼手術(shù)、化學(xué)治療后的又一重要治療手段。黑色素瘤疫苗是利用黑色素腫瘤細(xì)胞或腫瘤抗原物質(zhì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的特異性細(xì)胞和體液免疫反應(yīng),達(dá)到輔助殺傷腫瘤細(xì)胞目的,為主動(dòng)特異性免疫治療方法之一。 卡介苗(BCG

2、)是最早用于腫瘤輔助治療的一種生物制劑,近年來研究者發(fā)現(xiàn)其對(duì)白血病、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌和黑色素瘤都有輔助治療作用。人們?cè)诓粩嗟靥剿髌渲委熌[瘤免疫機(jī)制的同時(shí),從BCG里提取有效成分,并利用重組BCG等方法來提高治療腫瘤的效果且降低其副作用。為了探討具有免疫調(diào)節(jié)作用的結(jié)核桿菌濾過蛋白Ag85A能否作為佐劑誘導(dǎo)有效的抗黑色素瘤免疫效應(yīng),我們實(shí)驗(yàn)室在研究中成功構(gòu)建了結(jié)核桿菌Ag85A單表達(dá)、與細(xì)胞因子GM-CSF共表達(dá)重組質(zhì)粒,探討了結(jié)核桿菌A

3、g85A、及結(jié)核桿菌Ag85A與GM-CSF誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生有效抗腫瘤的免疫效應(yīng)。在此基礎(chǔ)上,本研究通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Ag85A與GM-CSF基因到黑色素瘤細(xì)胞(B16-F10,以下簡(jiǎn)稱B16),觀察結(jié)核桿菌Ag85A在作為異種抗原同時(shí),可否又作為免疫佐劑,增強(qiáng)小鼠抗腫瘤免疫效應(yīng)。本研究在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí),經(jīng)過Ag85A和GM-CSF修飾的腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)能夠明顯降低其致瘤性；有效促進(jìn)IFN-γ的分泌；增強(qiáng)NK、CTL細(xì)胞殺傷活性。具體體現(xiàn)在以

4、下兩個(gè)部分： 一、基于結(jié)核桿菌Ag85A表達(dá)載體的設(shè)計(jì)、構(gòu)建與鑒定 目的：利用雙啟動(dòng)子真核表達(dá)質(zhì)粒pRSC,分別構(gòu)建結(jié)核桿菌Agg5A表達(dá)重組質(zhì)粒pRSC-Ag85A以及結(jié)核桿菌Ag85A與細(xì)胞因子GM-CSF共表達(dá)重組質(zhì)粒pRSC-Ag85A/GMCSF。方法：用PCR方法從pIRES-Ag85A重組質(zhì)粒中擴(kuò)增出Ag85A基因,分別將其連接到重組質(zhì)粒pRSC-GMCSF以及空質(zhì)粒pRSC上,得到表達(dá)重組質(zhì)粒pRSC-A

5、g85A/GMCSF、pRSC-Ag85A。結(jié)果：經(jīng)酶切、基因測(cè)序、RT-PCR證實(shí),重組質(zhì)粒構(gòu)建正確并能在黑色素瘤細(xì)胞成功表達(dá)目的基因。結(jié)論：基于Ag85A與GM-CSF的表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,為研究不同基因轉(zhuǎn)染(pRSC-GMCSF、pRSC-Ag85A、pRSC-Ag85A/GMCSF)的腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)抗腫瘤免疫效應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。 二、基于表達(dá)結(jié)核桿菌Ag85A黑色素瘤細(xì)胞誘發(fā)抗腫瘤免疫效應(yīng)與機(jī)制的研究 目的：研究共表

6、達(dá)結(jié)核桿菌Ag85A與GM-CSF的B16誘發(fā)的抗腫瘤免疫效應(yīng)及評(píng)價(jià)Ag85A在抗腫瘤免疫效應(yīng)中能否發(fā)揮抗原及佐劑作用。方法：將不同基因修飾的腫瘤細(xì)胞注射小鼠,經(jīng)測(cè)量腫瘤大小觀察其致瘤性的強(qiáng)弱,荷瘤鼠的生存期,檢測(cè)小鼠脾CTL與NK細(xì)胞殺傷活性以及血清細(xì)胞因子IFN-γ水平,并通過病理切片分析免疫鼠抗腫瘤細(xì)胞免疫效應(yīng)。結(jié)果：注射共表達(dá)結(jié)核桿菌Ag85A與GM-CSF B16細(xì)胞組小鼠生存期明顯延長,IFN-γ的分泌顯著增高,荷瘤鼠CTL