(+)兒茶素對神經(jīng)元缺血損傷的保護作用及其對酸敏感離子通道影響的研究.pdf

1、目的:
　　 腦缺血損傷是困擾人類的疾病之一,其病理病生機制較為復雜。近年來研究顯示ASICs(酸敏感離子通道)與腦缺血發(fā)生時的酸中毒和鈣超載有著密切關系。兒茶素類是綠茶當中主要的茶多酚類活性物質(zhì),具有保護腦缺血等多種因素導致的神經(jīng)元損傷的作用,但作用機制尚不明確。本研究的目的在于進一步研究(+)兒茶素類藥物對缺血再灌注損傷的保護作用和酸中毒損傷的保護作用,利用全細胞膜片鉗方法來考察兒茶素類藥物是否作用于酸敏感離子通道電流,從而

2、為(+)兒茶素治療腦缺血疾病提供新的依據(jù)。
　　 方法:
　　 新生大鼠皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng),加入阿糖胞苷抑制非神經(jīng)元的生長,采用NSE(神經(jīng)元特異性烯醇化酶)免疫化學染色鑒定神經(jīng)元純度。利用MTT比色法研究神經(jīng)元的細胞存活率與酸損傷時間的關系。分別建立酸損傷模型和OGD／R(氧糖剝奪／再恢復)損傷模型,同時設立阿米洛利(10μmol／1)陽性對照組、正常對照組、(+)兒茶素A、B、C、D(1、0.5、0.25、0.1mm

3、ol／l)藥物處理組,模型損傷組,MTT比色法檢測各組細胞存活率,形態(tài)學觀察比較,檢測各個組NOS,LDH的釋放。全細胞膜片技術觀察(+)兒茶素對酸誘導的大鼠皮層神經(jīng)元ASICs的電流的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1(+)兒茶素對酸環(huán)境下皮層神經(jīng)元損傷的保護作用
　　 (1):皮層神經(jīng)元酸環(huán)境下處理4h,各組的細胞存活率如下(％):正常組(100±0.00),模型組(29.13±1.89),amiloridum組

4、(48.07±4.27),(+)-catechinA組(37.30±6.26),(+)-catechin B組(42.66±1.41),(+)-catechin C組(43.24±2.99),(+)-catechin D組(41.94±2.45)。
　　 與正常組相比,模型組和藥物處理組細胞存活率明顯下降(P<0.01)；與模型組相比,藥物處理組細胞存活率均可顯著提高(P<0.05)；(+)-catechin A組和(+)-ca

5、techin D組細胞存活率明顯低于amiloridum組(P<0.05)；(+)-catechin B組和(+)-catechin C組細胞存活率與amiloridum組比較無明顯差異(P>0.05)。(2):皮層神經(jīng)元酸環(huán)境下處理4h,各組的細胞外液LDH含量如下(U／L):正常組(112.9±9.62),模型組(463.7±13.85),amiloridum組(288.2±20.10),(+)-catechinA組(314.4±1

6、4.74),(+)-catechin B組(336.3±14.69),(+)-catechin C組(344.8±26.24),(+)-catechin D組(381.2±15.66)。
　　 模型組和藥物處理組細胞外液中的LDH含量與正常組相比明顯升高(P<0.01)；與模型組相比,藥物處理組細胞外液中LDH含量均可顯著降低(P<0.05)；(+)-catechin C組和(+)-catechin D組LDH含量明顯高于ami

7、loridum組(P<0.05)；(+)-catechinA組和(+)-catechin B組細胞外液中LDH含量與amiloridum組比較無明顯差異(P>0.05)。
　　 (3):皮層神經(jīng)元酸環(huán)境下處理4h,各組的細胞外液NOS含量如下(U／ml):正常組(0.67±0.098),模型組(1.75±0.095),amiloridum組(1.15±0.087),(+)-catechinA組(1.23±0.190),(+)-c

8、atechin B組(1.28±0.092),(+)-catechin C組(1.43±0.140),(+)-catechin D組(1.49±0.085)。
　　 模型組和藥物處理組細胞外液中的NOS含量與正常組相比明顯升高(P<0.01)；與模型組相比,藥物處理組細胞外液中NOS含量均可顯著降低(P<0.05)；(+)-catechin C組和(+)-catechin D組LDH含量明顯高于amiloridum組(P<0.0

9、5)；(+)-catechin A組和(+)-catechin B組細胞外液中LDH含量與amiloridum組比較無明顯差異(P>0.05)。
　　 2(+)兒茶素對氧糖剝奪再恢復損傷的保護作用
　　 (1):皮層神經(jīng)元經(jīng)氧糖剝奪再恢復(OGD／R)損傷,各組的細胞存活率如下(％):正常組(100±0.00),模型組(35.27±3.41),amiloridum組(48.50±1.94),(+)-catechinA組(

10、52.53±3.79),(+)-catechin B組(57.22±2.99),(+)-catechin C組(58.68±1.80),(+)-catechin D組(50.75±2.29)。
　　 模型組和藥物處理組的細胞存活率比正常組相比顯著下降(P<0.01);與模型組相比,藥物處理組的細胞存活率均可顯著提高(P<0.05)；(+)-catechin B組和(+)-catechin C組細胞存活率明顯高于與阿米洛利組相比(

11、P<0.05)；而(+)-catechin A組和(+)-catechin D組于與阿米洛利組相比無顯著差異(P>0.05)。
　　 (2):皮層神經(jīng)元經(jīng)氧糖剝奪再恢復(OGD／R)損傷,各組的細胞外液LDH含量如下(U／L):正常組(151.6±8.58),模型組(672.3±28.51),amiloridum組(398.5±23.82),(+)-catechin A組(385.7±29.08),(+)-catechin B組

12、(406.3±41.88),(+)-catechin
　　 C組(434.8±33.27),(+)-catechin D組(457.9±19.36)。
　　 模型組和藥物處理組細胞外液中的LDH含量與正常組相比明顯升高(P<0.01)；與模型組相比,藥物處理組細胞外液中LDH含量均可顯著降低(P<0.05)；(+)-catechin A組、(+)-catechin B組、(+)-catechin C組細胞外液中LDH含量

13、和amiloridum組相比無顯著差異(P>0.05)；(+)-catechin D組細胞外液中LDH含量明顯高于amiloridum組(P<0.05)。
　　 (3):皮層神經(jīng)元經(jīng)氧糖剝奪再恢復(OGD／R)損傷,各組的細胞外液LDH含量如下(U／ml):正常組(1.04±0.125),模型組(3.05±0.163),amiloridum組(2.25±0.111),(+)-catechinA組(1.84±0.147),(+)-

14、catechin B組(1.87±0.201),(+)-catechin C組(2.26±0.266),(+)-catechin D組(2.42±0.092)。
　　 模型組和藥物處理組細胞外液中的NOS含量與正常組相比明顯升高(P<0.01)；與模型組相比,藥物處理組細胞外液中NOS含量均可顯著降低(P<0.05):(+)-catechin C組、(+)-catechinD組和amiloridum組相比無顯著差異(P>0.05

15、)；(+)-catechinA組(+)-catechinB組細胞外液中NOS含量明顯低于amiloridum組(P<0.05)。
　　 3(+)兒茶素對酸誘導的ASICs電流的影響
　　 10μmol／l amiloridum和500umol／l(+)-catechin與在不加藥物條件pH6.0刺激誘發(fā)的ASICs電流幅值均明顯下降(P<0.01),其中10μmol／l amiloridum作用下電流下降至65.2±4.

16、13％(n=8-12),而500μmol／l(+)-catechin下降至81.7±3.74％(n=8—12)。500μmol／l(+)-catechin電流幅值明顯高于10μmol／lamiloridum(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.皮層神經(jīng)元經(jīng)酸環(huán)境和缺氧缺糖再恢復損傷時細胞存活率顯著降低,
　　 (+)-catechin可以明顯提高兩種模型下的細胞存活率,降低LDH釋放和NOS含量。2.(+)