刺五加多糖對(duì)人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞的抑制作用及免疫調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、目的：最近幾十年，來源于高等植物、藻類、地衣及大型真菌的植物多糖，因其廣譜治病性、低毒且副作用小的特點(diǎn)已經(jīng)引起生物醫(yī)學(xué)界極大的關(guān)注。植物多糖已經(jīng)成為理想的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤新藥的候選。從眾多的植物多糖中篩選出抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用好的多糖是目前醫(yī)藥學(xué)界重要的任務(wù)之一。 刺五加(Acanthopanax senticosus Harms)，又名五加參、刺拐棒，屬于五加科，是一種珍貴藥用植物，作為一種傳統(tǒng)的中藥，很久以前就用于治療許多種

2、疾病，如腦血管病、糖尿病、腫瘤、心血管病、高血壓、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，也用于減緩壓力和疲勞。刺五加中含有多種有效成分如甙類、苷類、三萜類、黃酮、多糖、維生素和礦質(zhì)元素等，這些成分有不同的生物學(xué)活性。 刺五加多糖(ASPS)是從刺五加的根及莖皮中提取出的生物活性多糖，具有提高免疫力、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、降血糖和降血脂、抗衰老等作用。實(shí)驗(yàn)證明ASPS可以增加淋巴細(xì)胞的增殖、促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬。可以顯著抑制S180的生長(zhǎng)、延長(zhǎng)荷瘤鼠的存

3、活時(shí)間，但是對(duì)其抗腫痛、免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制還不清楚。 本研究首先用ASPS與經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明具有抗腫瘤作用和免疫調(diào)節(jié)作用的植物多糖，即來自高等植物的黃芪多糖(APS)來自大型真菌的靈芝多糖(GLP)和滑菇多糖(PNP)，通過MTT法等，對(duì)白血病細(xì)胞株K562的抑制作用及對(duì)小鼠體外脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用進(jìn)行比較研究。在此基礎(chǔ)上選取了不同來源的腫瘤細(xì)胞株即K562、H446、SMMC-7721、BGC、HeLa細(xì)胞株，選出ASPS抑制作用最

4、強(qiáng)的細(xì)胞株。然后采用MTT、流式細(xì)胞技術(shù)、Hoechst33258染色、Western印跡、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法、RT-PCR等方法進(jìn)一步從細(xì)胞水平、分子水平研究ASPS對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡及其相關(guān)基因表達(dá)的影響，對(duì)細(xì)胞周期阻滯及相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)通路的影響，對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞的體外激活作用及細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響。為ASPS的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。 材料與方法： 1.四種植物多糖的抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用比較 四種植物多糖由河北師范

5、大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。BALB/c小鼠由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。 1.1 細(xì)胞培養(yǎng) K562、H446、SMMC-7721、BGC、HeLa細(xì)胞采用含有10％新生牛血清、青霉素100 u/mL、鏈霉素100μg/mL的RPMI-1640培養(yǎng)基。置于37℃，5％CO2，飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。 1.2 mTT檢測(cè)抑制率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以1×105/mL細(xì)胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μL

6、，24h后加入100μL用無血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋的四種多糖，終濃度為25、50、100、200、400μg/mL。對(duì)照組加等量的無血清培養(yǎng)基。每種藥物濃度均做8個(gè)復(fù)孔，在分別培養(yǎng)24、48、72h后，每孔加MTT20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心(2000轉(zhuǎn)/分)，10min，棄去上清，每孔加二甲基亞楓150mL，震蕩10min，用酶標(biāo)儀測(cè)490 nm的A值。根據(jù)下列公式計(jì)算抑制率：抑制率=[(對(duì)照組A-實(shí)驗(yàn)組A)/對(duì)照組A×10

7、0％，并根據(jù)以上結(jié)果用82798-IC50軟件計(jì)算出四種多糖作用的半數(shù)抑制濃度(IC50)。 1.3 生長(zhǎng)曲線的繪制取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以8×104/mL細(xì)胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入1mL，24h后加入1mL用無血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋的多糖，終濃度為50，100，200，400μg/mL；對(duì)照組加等量的無血清培養(yǎng)基。每種多糖濃度均做4個(gè)平行孔。在培養(yǎng)至24、48、72、96、120h后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算每毫

8、升溶液中細(xì)胞的數(shù)目，繪制生長(zhǎng)曲線。 1.4 脾淋巴細(xì)胞制備處死小鼠，無菌切取小鼠脾臟，研磨器輕輕研磨，200目不銹鋼網(wǎng)過濾，制成脾細(xì)胞懸液。用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，Hanks液洗滌2次，RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為6×106/mL。 1.5 多糖對(duì)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響96孔培養(yǎng)板中每孔加入100μL脾細(xì)胞懸液，再加入100μL不同濃度的多糖樣品。每一樣品均設(shè)有加ConA(終濃度為5 g/mL)的

9、實(shí)驗(yàn)組與不加ConA對(duì)照組，同時(shí)設(shè)不加樣品的陰性對(duì)照組。每組設(shè)8孔重復(fù)，置37℃，5％CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入20μLmTT(2mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，每孔加入DMSO 150μL裂解細(xì)胞后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定A值，計(jì)算刺激指數(shù)，SI=實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A。 1.6 ASPS對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株的抑制作用的比較研究采用MTT法。 2. ASPS誘導(dǎo)人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)

10、胞凋亡 2.1 ASPS對(duì)H446細(xì)胞增殖的抑制作用，采用MTT法。 2.2 Hoechst 33258熒光染色觀察細(xì)胞凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL細(xì)胞濃度接種于24孔板中，每孔瓶加入1 mL。24 h后加入1 mL用無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋的ASPS，終濃度為240、480、960μg/mL。對(duì)照組加1 mL無血清培養(yǎng)基。每組均做3個(gè)復(fù)孔，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后，用PBS(pH 7.

11、2)漂洗2次，多聚甲醛室溫固定30 min，蒸餾水洗3次。Hoechst 33258(5 mg/L)染色。30 min后蒸餾水漂洗除去染液，熒光顯微鏡觀察照相。 2.3 流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率EDTA消化收集細(xì)胞，冷PBS洗3次，70％乙醇固定細(xì)胞24 h，上機(jī)測(cè)定前離心去乙醇，用PBS洗兩次，加100μg/mL RNase 37℃消化30 min。50 μg/mL碘化丙錠(propidium iodide，PI)

12、染色30 min，經(jīng)尼龍網(wǎng)過濾后，用FACSTARCalibur型流式細(xì)胞儀測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件ModFit LT2.0處理，計(jì)算凋亡率。 2.4 western印跡分析檢測(cè)ASPS對(duì)p53、bcl-2、bax基因表達(dá)水平的影響提取細(xì)胞全蛋白，用考馬斯亮蘭G250試劑盒測(cè)定蛋白濃度。每梳孔加150 μg樣品蛋白。采用SDS-PAGE不連續(xù)變性蛋白質(zhì)電泳，電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠的底部，參照標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)，截取相應(yīng)位置的凝膠

13、轉(zhuǎn)膜，封閉后結(jié)合一抗，4℃過夜，漂洗后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗結(jié)合，化學(xué)發(fā)光顯色，將X光膠片掃描后，采用UVP-Lab work 4.60分析軟件分析條帶光密度。并分析結(jié)果。以目標(biāo)基因與β-肌動(dòng)蛋白基因產(chǎn)物的吸光度比值計(jì)算表達(dá)水平。 2.5 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)ASPS對(duì)p53、bcl-2、bax基因表達(dá)的影響細(xì)胞處理同2.2，終止培養(yǎng)后，棄掉培養(yǎng)液，PBS洗3次，細(xì)胞載片4％的多聚甲醛30 min。0.3％Triton

14、X-100孵育1次20 min，PBS清洗標(biāo)本3次各5 min，用3％H2O2去離子水室溫孵育5 min，蒸餾水沖洗，按免疫熒光試劑盒說明進(jìn)行免疫染色，溶性封片劑(PBS：甘油=1:1)封片。熒光顯微鏡觀察。 3. p-38、ERK通路在ASPS誘導(dǎo)人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞G2/M期阻滯中的作用 3.1 流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期分布。方法同2.3。 3.2 western印跡分析檢測(cè)ASPS對(duì)ERK、p

15、-ERK、p38、p-P38蛋白的影響方法同2.4。 3.3免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)ASPS對(duì)p-ERK、p-P38蛋白的影響方法同2.5。 4. ASPS的免疫調(diào)節(jié)作用 4.1 巨噬細(xì)胞的收集和培養(yǎng): 實(shí)驗(yàn)前3天，給小鼠腹腔注射1mL可溶性淀粉，處死小鼠，腹腔內(nèi)注射PBS液5 mL，輕揉腹部，在腹膜中央剪一小口，用吸管抽出灌洗液。1000r/min離心10min，用Hanks液離心洗滌細(xì)胞兩次，RPMI-164

16、0重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為106/mL，種在96孔板中，37℃、 5％CO2培養(yǎng)2～4h，棄上清，用37℃預(yù)溫的PBS洗滌2次，洗去未貼壁的細(xì)胞，貼壁的為腹腔巨噬細(xì)胞。 4.2 細(xì)胞活力檢測(cè)采用中性紅法檢測(cè)細(xì)胞活力。ASPS處理48h的腹腔巨噬細(xì)胞，PBS洗滌，加入新鮮配制的中性紅50ng/mL工作液，在37℃、濃度5％CO2條件下，培養(yǎng)3h。棄去上清液，用PBS洗滌一遍，加入萃取液(乙醇：水：醋酸=50:49:1)，酶標(biāo)儀檢測(cè)

17、540nm的吸光值?；盍τ?jì)算公式如下：細(xì)胞活力=[加藥孔(A)/對(duì)照孔(A)]×100％。 結(jié)論： 1. 四種植物多糖對(duì)K562細(xì)胞的增殖都具有抑制作用，ASPS的抑制作用高于APS、GLP和PNP。 2. ASPS、GLP、PNP能誘導(dǎo)對(duì)小鼠體外脾淋巴細(xì)胞的增殖，ASPS、PNP誘導(dǎo)作用較強(qiáng)。三種多糖對(duì)小鼠體外脾淋巴細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)與ConA之間沒有協(xié)同作用。 3. ASPS對(duì)K562、H446細(xì)胞增殖的