肺微血管內(nèi)皮細胞功能表型變化與博萊霉素大鼠肺纖維化相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是機體對肺組織損傷的過度修復和重塑的病理結(jié)果，而肌成纖維細胞（myofibroblasts,MFbs）正是導致膠原大量分泌、組織過度修復的主要效應(yīng)靶細胞，其在間質(zhì)中數(shù)量增加并持續(xù)活化被認為是病程向纖維化進展的重要標志。MFbs主要由間質(zhì)中的成纖維細胞（fibroblasts,Fbs）轉(zhuǎn)化而來，后者在缺氧、促纖維化細胞因子等因素的誘導下表達MFbs的特征性蛋白分子——

2、α-SMA，從而轉(zhuǎn)化為MFbs，發(fā)揮更強的致纖維化作用，因此，大量活化的Fbs轉(zhuǎn)化為致纖維化能力更強的MFbs的病理過程是PF進程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。回顧文獻發(fā)現(xiàn)，肺微血管內(nèi)皮細胞（pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs）作為血管壁基本的結(jié)構(gòu)和功能單位，是血管屏障的重要組成部分，它不僅在生理狀態(tài)下調(diào)節(jié)血管內(nèi)外的物質(zhì)交換、穩(wěn)定機體的內(nèi)環(huán)境；還在病理狀態(tài)下超早期的發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，促進組織修復。

3、然而，它在消除致病因子對機體損傷的同時也可能由于某種原因而過度地發(fā)揮了介導免疫、炎癥反應(yīng)，加重組織缺氧，分泌過量細胞因子等生物學作用，從而促進了組織的纖維性修復。文獻顯示，上述病態(tài)的PMVECs功能可能在Fbs向MFbs轉(zhuǎn)化的病理過程發(fā)揮著重要作用，本實驗將采用ELISA、Western Blot、RT-PCR等方法檢測PMVECs中相關(guān)細胞因子的合成、分泌水平，并使用millicell細胞共培養(yǎng)體系，結(jié)合抗體中和試驗，研究體外共培養(yǎng)條

4、件下，BLM大鼠PMVECs對Fbs的生物學作用及其機制，進一步揭示PMVECs及其功能表型變化在PF早期病程中的作用。
　　方法：
　　SD大鼠，體重100±20g，雄性，以博萊霉素（Bleomycin，BLM）-A5溶液氣管內(nèi)灌注的方法誘導大鼠PF模型，并在相同條件下向正常大鼠氣管內(nèi)灌注等體積生理鹽水作為對照。分別于給藥后第3，7，14，21和28天處死大鼠，取外周肺組織留作原代培養(yǎng)PMVECs和Fbs，其余肺組織用10

5、g/L多聚甲醛固定后石蠟包埋、切片、VG染色。在各時間點原代培養(yǎng)PMVECs和Fbs后，利用ELISA、Western Blot、RT-PCR等方法檢測各組大鼠PMVECs合成、分泌細胞因子TGF-β1及CTGF的水平；并將各組大鼠PMVECs分別與預先培養(yǎng)、傳代的對照組大鼠Fbs共培養(yǎng)，采用細胞生長曲線測定、PCNA免疫組化染色、流式細胞染色、Western Blot等方法，檢測共培養(yǎng)后的Fbs的增殖、轉(zhuǎn)化及膠原合成能力，并以單培養(yǎng)的

6、各組大鼠Fbs的相應(yīng)功能作為陽性對照，進行比較分析；結(jié)合細胞因子抗體中和試驗檢測PMVECs細胞因子分泌功能的變化與其促Fbs增殖、轉(zhuǎn)化功能的相關(guān)關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1、BLM大鼠PMVECs的對數(shù)生長期較對照組大鼠PMVECs提前。
　　2、免疫熒光染色及WesternBlot檢測證實BLM誘導大鼠PF過程中PMVECs上調(diào)TGF-β1和CTGF蛋白的表達，且高峰出現(xiàn)在BLM氣管內(nèi)灌注后7天組PMVECs。經(jīng)RT

7、-PCR鑒定，BLM氣管內(nèi)灌注后7天組PMVECs中TGF-β1和CTGF的轉(zhuǎn)錄顯著升高。ELISA實驗證實，各組PMVECs培養(yǎng)上清中TGF-β1和CTGF的分泌水平與WesternBlot檢測的細胞中相應(yīng)蛋白的表達水平基本一致。
　　3、細胞免疫熒光染色及WesternBlot檢測證實BLM大鼠PMVECs中出現(xiàn)α-SMA蛋白的表達，其高峰亦位于BLM氣管內(nèi)灌注后7天組。
　　4、生長曲線及PCNA染色顯示與BLM氣管內(nèi)

8、灌注后7、14、21、28天組PMVECs共培養(yǎng)的Fbs的對數(shù)生長期提前，核增殖能力明顯高于對照組。流式細胞染色及Western Blot結(jié)果顯示與BLM氣管內(nèi)灌注后7天組PMVECs共培養(yǎng)的Fbs群中，MFbs數(shù)量顯著增加，α-SMA蛋白的表達亦明顯上調(diào)；與BLM氣管內(nèi)灌注后7、14天組PMVECs共培養(yǎng)的Fbs中ColⅠA1的表達顯著上調(diào)。
　　5、抗體中和試驗顯示，單獨使用TGF-β1抗體使共培養(yǎng)上清中TGF-β1的濃度下降

9、約53.15±8.91％，可使共培養(yǎng)的Fbs數(shù)量減少約23.39±2.12％，F(xiàn)bs群中MFbs百分比下降約4.68±0.86％（降幅約22.48％）；單獨使用CTGF抗體使共培養(yǎng)上清中CTGF的濃度下降約54.65±10.24％，可使共培養(yǎng)的Fbs數(shù)量減少約45.16±5.79％，F(xiàn)bs群中MFbs百分比下降約8.06±1.31％（降幅約38.71％）；而聯(lián)合使用TGF-β1和CTGF抗體使共培養(yǎng)上清中TGF-β1和CTGF濃度同比下

10、降約50％，可使共培養(yǎng)的Fbs數(shù)量減少約73.39±11.89％，F(xiàn)bs群中MFbs百分比下降約10.15±1.37％（降幅約48.75％）。
　　結(jié)論：
　　1、BLM誘導的大鼠PF過程中，PMVECs合成、分泌促纖維化細胞因子TGF-β1及CTGF的功能上調(diào)，尤其在病程早期，PMVECs合成、分泌細胞因子功能旺盛，細胞以分泌功能表型為主。
　　2、在體外共培養(yǎng)條件下，BLM大鼠PMVECs可促進正常鼠Fbs的增殖、