中華雪膽有效成分及抗炎活性研究;浙江栽培浙貝母種質(zhì)遺傳多樣性的AFLP分析.pdf

1、第一部分中華雪膽有效成分及抗炎活性研究 目的： 中華雪膽的塊根是常用中草藥，臨床主要用于治療炎癥性疾病。為了探討藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本文對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究。并對(duì)3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齊墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物4)和3-O-(6'-乙酯)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齊墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物11)進(jìn)行了抗炎活性觀察。 方法： 將中華雪膽塊根粉碎，70

2、％甲醇浸提。合并提取液，減壓回收甲醇。浸膏熱溶于1500 mL蒸餾水，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。用硅膠柱色譜(CC)、中壓制備色譜(MPLC)、高壓制備色譜(HPLC)等分離技術(shù)，從正丁醇、乙酸乙酯浸膏中共獲得20個(gè)化合物。用UV、IR、MS、NMR等波譜技術(shù)及相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比較，確定了正丁醇浸膏中13個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)。體外在脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7和J774A.1小鼠巨噬細(xì)胞上分別用蛋白質(zhì)印跡、酶聯(lián)免疫法觀察化合物

3、4和11對(duì)環(huán)氧合酶-1/-2(COX-1、COX-2)蛋白及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IF-6)表達(dá)的影響。 結(jié)果： 從中華雪膽的乙酸乙酯和正丁醇部位分離得到20個(gè)三萜皂苷類化合物，鑒定出其中13個(gè)化合物分別為齊墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(1)，3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齊墩果酸-28-O-α-L-阿拉伯糖苷(2)，3-O-(6'-丁酯)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齊墩果酸-28-O-β

4、-D-吡喃葡萄糖苷(3)，3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齊墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(4)，3-O-(6'-甲酯)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齊墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(5)，3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齊墩果酸-28-O-β-D-吡喃甘露糖苷(6)，3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齊墩果酸(7)，3-O-β-D-吡喃葡萄糖-齊墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖(8)，3-O-(6’-甲酯)-β-D-吡喃

5、葡萄糖醛酸-齊墩果酸-28-O-α-L-阿拉伯糖苷(9)，3-O-(6’-甲酯)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齊墩果酸-28-O-β-D-吡喃甘露糖苷(10)，3-O-(6’-乙酯)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齊墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(11)，3-O-α-L-阿拉伯糖-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齊墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(12)，3-O-β-D-吡喃葡萄糖-齊墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→

6、6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(13)。 3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齊墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物4)和3-O-(6’-乙酯)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齊墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物11)對(duì)COX-1表達(dá)無明顯影響，但是在RAW264.7和J774A.1小鼠巨噬細(xì)胞上兩化合物均能使COX-2蛋白的表達(dá)降低；也使LPS刺激的J774A.1小鼠巨噬細(xì)胞TNF-α、IF-6表達(dá)降低。 結(jié)論

7、: 除去化合物4和化合物12，其余化合物是首次從中華雪膽中分離得到，它們均屬于齊墩果烷型三萜皂苷。3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齊墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物4)和3-O-(6'-乙酯)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齊墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物11)具有一定的抗炎活性。 第二部分浙江栽培浙貝母種質(zhì)遺傳多樣性的AFLP分析 目的: 為了保護(hù)浙江省道地種植區(qū)栽培浙貝母的優(yōu)質(zhì)

8、資源，建立特異、分辨率高的DNA分子標(biāo)記生物學(xué)鑒定方法，為選育優(yōu)良品種及尋找良種繁育基地提供科學(xué)依據(jù)，我們采用AFLP分子標(biāo)記法對(duì)省內(nèi)6個(gè)居群的浙貝母栽培品種的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。 方法: 根據(jù)均勻分布、隨機(jī)取樣原則，收集浙貝母主產(chǎn)區(qū)鄞州、象山、東陽、磐安、永康、縉云六個(gè)種植區(qū)人工栽培樣本，每個(gè)種植鄉(xiāng)鎮(zhèn)收集4～6個(gè)樣品，共32份。采用AFLP方法：1、DNA酶切及人工接頭的連接(Restriction of the D

9、NAand ligation of oligonucieotidc adapters)，2、限制性片段的選擇性擴(kuò)增(Selective amplification ofsets of restriction fragments)，3、擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析(Gel analysis of the amplifiedfragments)。用POPGENE1.32軟件計(jì)算居群總遺傳多樣性(Ht)、居群內(nèi)遺傳多樣性(Hs)、遺傳分化系數(shù)(Gst

10、)、基因流(Hm)、Nei遺傳多樣性指標(biāo)(h)、Shannon信息指數(shù)(I)、遺傳距離、并形成聚類圖。 結(jié)果: 在浙貝母的物種水平上，Nei’s基因多樣性指數(shù)(He)為0.169 O±0.1757，Shannon’s信息指數(shù)(I)為0.2698±0.2453，多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB)76.85％；總遺傳多樣性(Ht)01690±0.0309，其居群水平上遺傳多樣性(He)0.1508±0.0240，Shannon's信息

11、指數(shù)(I)0.2333±0.2619，多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB)50.38％，Nei's遺傳分化指數(shù)(Gst)為0.1076，基因流(Aim)為4.1470。東陽和永康種群之間的遺傳距離最小(為0.0150)，距離東陽和永康較近的縉云居群的遺傳距離次之(為0.0215)，而象山與縉云最遠(yuǎn)(為0.0324)。居群間的遺傳一致度和遺傳距離范圍分別是0.9681～0.9851和0.015 O～0.0324。聚類圖結(jié)果表明：地理位置相對(duì)較近的東陽

12、、永康種群表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系首先聚為一類；再與縉云聚為1個(gè)亞類；鄞州、磐安種群分別聚為2個(gè)亞類；象山種群遺傳距離較遠(yuǎn)，單獨(dú)聚為一大類。 結(jié)論: 浙江省主產(chǎn)區(qū)栽培浙貝母物種的遺傳多樣性水平豐富，高的遺傳多樣性能夠維持浙貝母的長期生存。浙貝母居群間的多樣性水平明顯低于居群內(nèi)的多樣性水平，居群間遺傳分化不明顯，而且廣泛的基因交流保證了藥材品質(zhì)的均一性和質(zhì)量的穩(wěn)定性，也使這些種植區(qū)成為選育優(yōu)良品種的良好基地。但是鄞州和象山兩個(gè)