bFGF和BMP12基因聯(lián)合修飾BMSCs后向韌帶成纖維細(xì)胞分化的實驗研究.pdf

1、韌帶重建是目前骨科學(xué)領(lǐng)域的重要課題，自體韌帶移植、同種異體韌帶移植及人工材料等韌帶重建手術(shù)均存在如增加創(chuàng)傷、免疫排斥及效果不佳等問題。而隨著近年來組織工程的飛速發(fā)展，為肌腱和韌帶的修復(fù)提供了新的思路，尤其是種子細(xì)胞、生長因子、轉(zhuǎn)基因、支架材料以及體外生物反應(yīng)器的不斷發(fā)展，使組織工程韌帶具有巨大的發(fā)展?jié)摿?，以期解決目前肌腱和韌帶修復(fù)術(shù)中產(chǎn)生的一系列問題。而在組織工程韌帶的構(gòu)建過程中種子細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化尤為重要，雖然支架可以提供暫時的機(jī)械支

2、持，但組織工程韌帶的長期有效性取決于種子細(xì)胞產(chǎn)生韌帶細(xì)胞外基質(zhì)的能力，因此種子細(xì)胞的選擇和改造將影響到組織工程韌帶最終的結(jié)果，這也是組織工程的關(guān)鍵。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化潛能，是目前組織工程中最常用的種子細(xì)胞之一，具有擴(kuò)增容易、取材方便、細(xì)胞粘附性能優(yōu)良等特點。雖然骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在韌帶組織工程中已得到較廣泛的應(yīng)用，但直到

3、目前尚無比較明確的使其向韌帶成纖維細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)技術(shù)。堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)具有明顯的促細(xì)胞生長和誘導(dǎo)血管生成作用，最近研究還發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長因子家族還在肌腱和韌帶的早期發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而骨形態(tài)發(fā)生蛋白12(bone morphogenetic protein12，BMP12)是目前發(fā)現(xiàn)的與韌帶形成和發(fā)育最關(guān)鍵的因子，兩種細(xì)胞因子的聯(lián)合應(yīng)用不僅可以充

4、分發(fā)揮韌帶成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)作用，還具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)血管形成的功能。我們的前期研究結(jié)果顯示攜帶bFGF基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染BMSCs后，細(xì)胞增殖能力得到顯著增強(qiáng)，但細(xì)胞形態(tài)的轉(zhuǎn)變和韌帶特異性細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)尚不理想，在本課題中，我們即通過腺病毒將兩種細(xì)胞生長因子高效轉(zhuǎn)染兔BMSCs，觀察兩種因子對BMSCs向韌帶成纖維細(xì)胞(Ligament Fibroblast，LF)分化的影響，探索一種優(yōu)良的韌帶組織工程種子細(xì)胞。 1、分離

5、、培養(yǎng)兔BMSCs和LF，并對兩種細(xì)胞進(jìn)行分子生物學(xué)鑒別 分別通過Percoll密度梯度離心法和組織塊培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)兔BMSCs和髕韌帶LF。MTT法檢測兩種細(xì)胞的增殖活性，通過HE染色、堿性磷酸酶染色、透射電鏡及掃描電鏡等觀察兩種細(xì)胞的生物學(xué)特征，為兩種細(xì)胞的鑒定提供細(xì)胞學(xué)和形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD45及HLA-DR在兩種細(xì)胞中的表達(dá)。熒光免疫組化分析Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅴ型膠原、腱糖

6、蛋白-C、纖維連接蛋白和波形蛋白在兔BMSCs及LF細(xì)胞中的表達(dá)差異，最后對Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅴ型膠原、腱糖蛋白-C、纖維連接蛋白、波形蛋白以及seleraxis在兩種細(xì)胞中的mRNA表達(dá)進(jìn)行RT-PCR分析。 2、分別構(gòu)建攜帶人BMP12和bFGF基因的重組腺病毒 通過BMP12基因(NM182828)特異引物從人胎盤組織中擴(kuò)增和分離純化BMP12基因CDS序列，正向引物(帶SalⅠ位點)：CGCGTCGACATGG

7、ACCTGAGCGCCGCCGC；反向引物(帶HindⅢ位點)：CCAAGCTTCCTGCAGCCGCAGGCCTCCAC，并構(gòu)建重組質(zhì)粒pShuttleCMV．BMP12-eGFP。將重組質(zhì)粒pShuttleCMV．BMP12-eGFP通過第二代腺病毒載體AdEasyTM系統(tǒng)構(gòu)建Ad．BMP12-eGFP重組腺病毒，并進(jìn)行鑒定和擴(kuò)增，同時擴(kuò)增Ad．bFGF-eGFP重組腺病毒(長征醫(yī)院朱巍博士饋贈)，其中eGFP熒光蛋白為報告基因。通

8、過流式細(xì)胞儀檢測腺病毒轉(zhuǎn)染效率，同時測定腺病毒濃度和體外轉(zhuǎn)染的安全性。最后通過免疫組化鑒定構(gòu)建的重組腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后BMP12和bFGF蛋白的表達(dá)，并通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后BMP12和bFGF蛋白在BMSCs內(nèi)持續(xù)表達(dá)的時間。 3、觀察bFGF和BMP12基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染后BMSCs向LF分化的作用 將BMSCs隨機(jī)分為三組，即對照組、Ad．bFGF-eGFP單獨轉(zhuǎn)染組和Ad．bFGF-eGFP及Ad．BMP12-eGFP

9、共轉(zhuǎn)染組，于37℃、5％CO2孵箱中體外培養(yǎng)。分別以MOI值100轉(zhuǎn)染BMSCs后，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，用MTT法檢測三組細(xì)胞的增殖活性，堿性磷酸酶染色、透射電鏡及掃描電鏡觀察三組細(xì)胞的生物學(xué)特征。Western-blot半定量分析三組細(xì)胞第7天和第14天時細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅴ型膠原、腱糖蛋白-C、纖維連接蛋白和波形蛋白在蛋白水平的表達(dá)水平。用RT-PCR方法檢測三組細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅴ型膠原、腱糖

10、蛋白-C、纖維連接蛋白、波形蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子β1、二聚糖、核心蛋白多糖以及scleraxis mRNA在第7天和第14天時的表達(dá)水平。 1、分離培養(yǎng)的BMSCs與LF在大體形態(tài)學(xué)上相似，均表現(xiàn)為長梭形、漩渦狀生長，但二者在細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)、增殖特性、細(xì)胞表型、細(xì)胞分子生物學(xué)水平上均有顯著差異。MTT檢測結(jié)果顯示BMSCs的增殖活性明顯優(yōu)于LF。透射電鏡和掃描電鏡結(jié)果顯示LF較BMSCs具有更豐富的微絨毛結(jié)構(gòu)和細(xì)胞間纖維連接。流式

11、細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示BMSCs CD29和CD44表達(dá)陽性，陽性細(xì)胞百分率分別為96.35±3.62％和36.12±2.79％，CD45和HLA-DR表達(dá)陰性，LF除HLA-DR表達(dá)弱陽性外(8.14±1.21％)，CD29、CD44、CD45均為陰性表達(dá)。熒光免疫組化和RT-PCR分析結(jié)果表明，Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅴ型膠原、纖維連接蛋白和腱糖蛋白-C在LF中的表達(dá)均強(qiáng)于BMSCs，而波形蛋白的表達(dá)則較BMSCs弱。RT-PCR分析結(jié)果還

12、表明Scleraxis因子陽性表達(dá)于LF，而在BMSCs中表達(dá)陰性。兩種細(xì)胞的堿性磷酸酶染色均為陰性。 2、成功構(gòu)建了攜帶人BMP12基因的質(zhì)粒pShuttleCMV．BMP12-eGFP，對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和基因測序表明成功合成和整合了人BMP12基因。將重組質(zhì)粒pShuttleCMV．BMP12-eGFP通過第二代腺病毒載體AdEasyTM系統(tǒng)成功構(gòu)建了重組腺病毒Ad．BMP12-eGFP，對其再次進(jìn)行PCR檢測確定本

13、實驗構(gòu)建的重組腺病毒Ad．BMP12-eGFP包含目的基因BMP12。通過在293細(xì)胞內(nèi)的四代擴(kuò)增，我們得到了高滴度的Ad．BMP12-eGFP以及Ad．bFGF-eGFP病毒，分別約為2.5×109pfu/ml和2×109pfu/ml。通過對Ad．BMP12-eGFP和Ad．bFGF-eGFP病毒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞的體外安全性實驗，證明重組腺病毒純度高、毒性低，滿足體外和體內(nèi)實驗的標(biāo)準(zhǔn)。將Ad．BMP12-eGFP和Ad．bFGF-eG

14、FP病毒轉(zhuǎn)染BMSCs后，通過熒光顯微鏡和免疫組化的方法可以觀察到BMP12蛋白和bFGF蛋白的成功表達(dá)，并可在BMSCs內(nèi)持續(xù)表達(dá)8周以上。 3、通過對陰性對照組、Ad．bFGF-eGFP單獨轉(zhuǎn)染組以及Ad．bFGF-eGFP和Ad．BMP12-eGFP共轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞進(jìn)行比較性分析后，結(jié)果顯示bFGF基因和BMP12基因共同轉(zhuǎn)染組的BMSCs在大體形態(tài)學(xué)和細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)上均較對照組和bFGF基因單獨轉(zhuǎn)染組更接近LF的特征。bF

15、GF基因單獨轉(zhuǎn)染BMSCs后能明顯促進(jìn)細(xì)胞的增殖，并能不同程度增強(qiáng)韌帶特異性細(xì)胞外基質(zhì)在基因水平及蛋白水平的表達(dá)。而bFGF基因和BMP12基因共同轉(zhuǎn)染組的BMSCs增殖能力不但明顯增強(qiáng)，其膠原分泌能力、蛋白多糖的表達(dá)亦明顯優(yōu)于對照組和bFGF基因單獨轉(zhuǎn)染組，尤其是明顯促進(jìn)了韌帶成纖維細(xì)胞特異性分化標(biāo)志Tenascin-C的表達(dá)，并成功誘導(dǎo)了Scleraxis因子在BMSCs中的表達(dá)。三組細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)均為陰性，堿性磷酸酶的表達(dá)也無明

16、顯變化。 1、成功分離培養(yǎng)獲得兔BMSCs和LF，兩種細(xì)胞雖然在大體形態(tài)學(xué)上相似，但在細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)、增殖特性、細(xì)胞表型、細(xì)胞分子生物學(xué)水平上均有顯著差異。 2、成功構(gòu)建了攜帶人BMP12基因和bFGF基因的缺陷型重組腺病毒，體外研究證實其成功整合了人BMP12基因和bFGF基因并表達(dá)BMP12蛋白和bFGF蛋白，并同時具有滴度高、毒性低、轉(zhuǎn)染效率高的特點。 3、體外研究證實，Ad．bFGF-eGFP和Ad．BM

17、P12-eGFP以MOI100轉(zhuǎn)染BMSCs后，可在體外持續(xù)表達(dá)8周以上的時間，達(dá)到組織工程研究的要求。 4、bFGF基因單獨轉(zhuǎn)染。BMSCs后能明顯促進(jìn)細(xì)胞的增殖，并能不同程度增強(qiáng)韌帶特異性細(xì)胞外基質(zhì)在基因水平及蛋白水平的表達(dá)，但不能誘導(dǎo)韌帶成纖維細(xì)胞特異性分化標(biāo)志Scleraxis的表達(dá)。 5、bFGF基因和BMP12基因共同轉(zhuǎn)染組的BMSCs增殖能力不但明顯增強(qiáng)，其膠原分泌能力、蛋白多糖的表達(dá)亦明顯優(yōu)于bFGF基因