非病毒多基因納米傳遞與成纖維細胞的神經(jīng)分化研究.pdf

1、直接重編程是指將一種終末分化的細胞直接轉(zhuǎn)變成另一種終末分化的細胞，這一技術(shù)的產(chǎn)生為細胞移植在臨床中的應(yīng)用提供了新的細胞來源。在成神經(jīng)細胞分化的研究中主要依靠病毒載體，而病毒載體本身具有潛在的安全隱患，使該技術(shù)的應(yīng)用受到限制,納米粒具有安全、高效等優(yōu)點，已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注。本文重點圍繞神經(jīng)細胞的直接重編程展開研究，通過制備乙二胺修飾的陽離子化紫菜多糖，并將其作為基因載體攜神經(jīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，將小鼠成纖維細胞直接重編程為神經(jīng)細胞，主要分為

2、四個部分：
　　第一章綜述
　　本章對基因治療中載體的發(fā)展進行了簡要綜述，比較了不同載體的優(yōu)缺點，對各載體的應(yīng)用作了簡單介紹；并對可用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細胞來源，不同來源細胞的優(yōu)缺點以及細胞來源途徑的發(fā)展趨勢及面臨的問題進行了簡要敘述，為本學位論文設(shè)計思想的提出及后續(xù)實驗工作的開展奠定基礎(chǔ)。
　　第二章陽離子化紫菜多糖的制備及表征
　　本項目研究以紫菜多糖為對象，采用高碘酸鉀氧化法對紫菜多糖進行氧化，再利用乙二

3、胺及精胺兩種陽離子化試劑分別對氧化后的紫菜多糖進行陽離子化，得到乙二胺陽離子化紫菜多糖（Ed-PYP）和精胺陽離子化紫菜多糖（Sm-PYP），采用傅里葉變換紅外光譜分析儀對兩種陽離子化的多糖進行結(jié)構(gòu)檢測，采用Zeta電位粒徑儀對其進行表征，為進一步研究陽離子化紫菜多糖在基因載體中的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。
　　第三章乙二胺陽離子化的紫菜多糖作為基因載體的初步探究
　　以陽離子化多糖為載體，成纖維細胞為種子細胞，通過瓊脂糖凝膠電泳對Ed

4、-PYP/pDNA復(fù)合物表征，采用MTT實驗對其進行毒性檢測，實驗結(jié)果初步表明其具有載基因能力。通過綠色熒光蛋白（EGFP）及ELISA分別從可視化角度及蛋白水平來評價 Ed-PYP/pDNA復(fù)合物的體外轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果表明在Ed-PYP/pDNA質(zhì)量比為40:1，其體外轉(zhuǎn)染效率為最佳且優(yōu)于PEI及Lip2000。通過質(zhì)粒 DNA的熒光標記物 YOYO-1以及多種特異性抑制劑考察Ed-PYP/pDNA納米粒（40:1）的穿膜機制及胞內(nèi)轉(zhuǎn)運

5、機理。結(jié)果表明， Ed-PYP/pDNA復(fù)合物是通過網(wǎng)格蛋白以及小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進入胞內(nèi)，而其在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運過程是由內(nèi)涵體-溶酶體系統(tǒng)、細胞骨架結(jié)構(gòu)、中間纖維結(jié)構(gòu)以及動力蛋白多系統(tǒng)參與的。
　　第四章成纖維誘導(dǎo)分化為神經(jīng)的研究
　　根據(jù)前文研究結(jié)果，將Ed-PYP與神經(jīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的復(fù)合物按最佳比例（40:1）混合制成納米粒（Ed-PYP/pABF、Ed-PYP/pABT）用于轉(zhuǎn)染成纖維細胞，擬對其進行成神經(jīng)誘導(dǎo)分化，經(jīng)