HMGB1及LL-37在膽脂瘤性中耳炎的骨質(zhì)破壞和炎癥反應(yīng)機制中的作用.pdf

1、第一章:HMGB1在膽脂瘤性中耳炎的骨質(zhì)破壞機制中的作用
　　研究背景:中耳乳突膽脂瘤是常見病，也是難治性和慢性進(jìn)行性、破壞性疾病，其主要特征表現(xiàn)為中耳腔內(nèi)大量增殖的角化鱗狀上皮和鄰近骨質(zhì)破壞以及角化細(xì)胞凋亡，其中骨質(zhì)破壞作用是膽脂瘤的主要特征之一。由于膽脂瘤的骨質(zhì)破壞作用可以導(dǎo)致眾多顱內(nèi)外并發(fā)癥的發(fā)生，故現(xiàn)在的研究重點基本上集中在對膽脂瘤骨質(zhì)破壞機制的研究上。然而，對膽脂瘤引起骨質(zhì)破壞的確切原因尚不清楚，細(xì)胞因子參與的骨質(zhì)吸收作

2、用成為研究的熱點上。其中TNF-α和IL-1β被認(rèn)為是與膽脂瘤的骨質(zhì)破壞作用相關(guān)的重要的細(xì)胞因子，但對上述兩個細(xì)胞因子的來源尚不清楚。HMGB1是近年研究發(fā)現(xiàn)的一種重要的炎性介質(zhì)，是促炎細(xì)胞因子反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的中心環(huán)節(jié)，是新近發(fā)現(xiàn)的一種危險信號分子。細(xì)胞核內(nèi)的HMGB1的主要功能是DNA結(jié)合功能，無需特異的識別序列，能廣泛結(jié)合單鏈或雙鏈DNA，甚至能與受損的DNA結(jié)構(gòu)結(jié)合。由于HMGB1和DNA非特異結(jié)合的親和力低，能通過核孔在細(xì)胞核與胞漿間

3、進(jìn)行穿梭，與其他的核蛋白不同之處在于HMGB1可釋放到胞外，作為細(xì)胞因子，發(fā)揮著促炎、調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞軸突生長、腫瘤轉(zhuǎn)移以及動脈粥樣硬化和血管損傷后再狹窄等多種病理生理效應(yīng)。近年研究發(fā)現(xiàn)，胞外的HMGB1作為一種重要的炎癥介質(zhì)和致炎細(xì)胞因子，與關(guān)節(jié)炎、急性肺炎、膿毒癥、肝炎、自身免疫性疾病等的發(fā)病機理關(guān)系密切。盡管目前對HMGB-1在上述多種疾病的炎癥的發(fā)生發(fā)展中的作用有了較多的認(rèn)識和肯定，但在膽脂瘤性中耳炎中HMGB1的表達(dá)及釋放及其在該

4、病中所起的作用未有任何研究。
　　研究目的:HMGB1在正常外耳道上皮和膽脂瘤性中耳炎中的表達(dá)與定位及HMGB1刺激膽脂瘤上皮細(xì)胞后能否釋放炎癥細(xì)胞因子。
　　研究方法:1、采用免疫熒光的方法研究HMGB1在中耳膽脂瘤組織中的表達(dá)及定位。2、通過紫外線照射膽脂瘤上皮細(xì)胞建立膽脂瘤細(xì)胞凋亡模型。3、用凋亡上清液刺激膽脂瘤上皮細(xì)胞，觀察凋亡上清液刺激后HMGBI表達(dá)和釋放的規(guī)律。4、用凋亡上清液刺激膽脂瘤上皮細(xì)胞后，檢測培養(yǎng)上清

5、液中IL-1β、TNF-α的表達(dá)及釋放的變化，觀察這些因子的變化與HMGBI表達(dá)和釋放的關(guān)系。
　　結(jié)果:1、在膽脂瘤組織中HMGB-1表達(dá)出現(xiàn)亞細(xì)胞分布部位的改變，即角質(zhì)形成細(xì)胞的胞漿和胞外出現(xiàn)了強陽性的表達(dá)，角質(zhì)形成細(xì)胞的核內(nèi)表達(dá)減少（在原發(fā)性膽脂瘤組織中更明顯），而且表達(dá)總量較正常的外耳道上皮上調(diào)。2、用紫外線照射誘導(dǎo)膽脂瘤上皮細(xì)胞凋亡，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-24小時后，發(fā)現(xiàn)凋亡上清液中有HMGB1的表達(dá)。3、用凋亡上清液刺激

6、膽脂瘤上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)刺激后4h開始，細(xì)胞培養(yǎng)液中的HMGB1的含量明顯增加，并一直持續(xù)到48h。5、刺激前HMGB1蛋白主要分布在細(xì)胞核內(nèi)，胞漿中的含量幾乎沒有，用凋亡上清液刺激后1h后細(xì)胞漿內(nèi)的HMGB1蛋白含量逐漸增加達(dá)到高峰，隨后逐漸減少，至24小時胞漿內(nèi)的HMGB1的含量達(dá)到低谷（仍高于刺激前），隨后又逐漸升高，至刺激后48小時細(xì)胞漿內(nèi)的HMGB1蛋白的含量維持在較高的水平。6、用凋亡上清液刺激膽脂瘤上皮后，培養(yǎng)液中的TNF-α

7、的含量在刺激后1h開始增高，4小時達(dá)到高峰，在刺激后48小時，培養(yǎng)液中的TNF-α的含量維持在較高的水平;細(xì)胞培養(yǎng)液中的II-1β的含量在凋亡上清液刺激后1h開始增高，48h達(dá)到高峰（除12小時點外）。
　　結(jié)論:
　　1.在膽脂瘤組織中HMGB-1表達(dá)出現(xiàn)亞細(xì)胞分布部位的改變，即角質(zhì)形成細(xì)胞的胞漿和胞外出現(xiàn)了強陽性的表達(dá)。
　　2.膽脂瘤組織中胞外HMGB1的來源有兩個:一是膽脂瘤上皮細(xì)胞在凋亡過程中釋放;二是膽脂瘤

8、上皮細(xì)胞凋亡過程中釋放的凋亡產(chǎn)物誘導(dǎo)膽脂瘤上皮細(xì)胞主動釋放。
　　3.胞外的HMGB-1蛋白可以誘導(dǎo)膽脂瘤上皮細(xì)胞合成和釋放TNF-α和IL-1β，從而參與局部炎癥反應(yīng)及膽脂瘤對周圍骨質(zhì)的吸收破壞。
　　第二章:LL-37在膽脂瘤性中耳炎的炎癥反應(yīng)機制中的作用
　　研究背景:中耳膽脂瘤是一種常見病，其主要的特征表現(xiàn)為中耳腔存在大量的、增殖的、角化的鱗狀上皮和鄰近骨質(zhì)的破壞，以及程序性角化細(xì)胞凋亡。中耳膽脂瘤的重要特征之

9、一是上皮的過度增殖和凋亡增強。研究表明細(xì)胞凋亡增多，對凋亡細(xì)胞產(chǎn)物的清除減少，凋亡的細(xì)胞會釋放大量的DNA片段到胞外環(huán)境中。胞外的DNA通過刺激或抑制免疫細(xì)胞的活性從而起到免疫調(diào)節(jié)的功能。DNA的這些免疫調(diào)節(jié)作用暗示固有免疫反應(yīng)的免疫原不僅僅是病原體的DNA（細(xì)菌的，病毒的），也可以是異常的或不應(yīng)該存在的DNA片段。LL37是迄今為止在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的惟一的cathelicidins家族抗菌肽，LL-37在固有免疫系統(tǒng)中的重要作用是它可以與

10、自身DNA結(jié)合形成一種免疫復(fù)合物，打破了針對自身DNA的天然耐受，激活pDC內(nèi)的TLR9并誘導(dǎo)IFN的產(chǎn)生。盡管目前對LL-37在銀屑病、自身免疫性疾病等疾病中作用有了較多的認(rèn)識和肯定，但在膽脂瘤性中耳炎中LL-37的表達(dá)及其在該病中所起的作用未有任何研究。
　　研究目的:DNA片段在原發(fā)性膽脂瘤和繼發(fā)性膽脂瘤中的表達(dá)以及DNA片段在膽脂瘤性中耳炎的炎癥反應(yīng)機制中的作用。
　　研究方法:1、采用Tunel方法研究在膽脂瘤上皮

11、細(xì)胞在凋亡過程中有無DNA釋放到胞漿及胞外。2、通過免疫熒光及western blot方法檢測膽脂瘤組織中LL-37及MxA的表達(dá)情況。3、采用CPG-DNA、LL-37、CPG-DNA+LL-37刺激膽脂瘤上皮細(xì)胞，觀察刺激后TLR-9及IFN-α表達(dá)和釋放的規(guī)律。
　　結(jié)果:1、在膽脂瘤組織的角質(zhì)形成細(xì)胞的胞漿和胞外出現(xiàn)了DNA片段的強陽性表達(dá)。2、LL-37在正常的外耳道上皮組織中呈弱陽性表達(dá);在伴鼓膜完整的原發(fā)性膽脂瘤中無

12、表達(dá);在伴鼓膜穿孔的原發(fā)性膽脂瘤及繼發(fā)性膽脂瘤中LL-37呈強陽性表達(dá)，這兩者的表達(dá)總量相當(dāng)，較伴鼓膜完整的原發(fā)性膽脂瘤和正常的外耳道上皮上調(diào)。3、MxA在正常的外耳道上皮組織中無表達(dá);在伴鼓膜完整的原發(fā)性膽脂瘤中呈無表達(dá)表達(dá);在伴鼓膜穿孔的原發(fā)性膽脂瘤組織中呈陽性表達(dá)，在繼發(fā)性膽脂瘤中MxA呈強陽性表達(dá)，表達(dá)總量較伴或不伴鼓膜穿孔的膽脂瘤和正常的外耳道上皮上調(diào)。4、正常培養(yǎng)的膽脂瘤上皮細(xì)胞和凋亡的膽脂瘤上皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)有DNA片段的存

13、在。5、CPG-DNA+LL-37聯(lián)合刺激組中可檢測到IFN-α基因的表達(dá)上調(diào)，而CPG-DNA和LL-37單獨刺激組中未見IFN-α基因的表達(dá)上調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1.膽脂瘤組織中存在DNA片段，這為角質(zhì)形成細(xì)胞或免疫細(xì)胞識別這些未被降解的DNA片段提供了基礎(chǔ)。
　　2.膽脂瘤上皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)本身就存在DNA片段以及膽脂瘤上皮細(xì)胞在凋亡過程中可以釋放DNA片段，這成為膽脂瘤組織中DNA片段的來源。
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