人肝癌細胞Fas-FasL途徑免疫逃逸機制及其反義寡核苷酸、細胞因子的逆轉作用.pdf

1、目的：腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與細胞凋亡及機體免疫功能的異常關系密切，通過Fas/FasL系統(tǒng)抵抗Fas介導的凋亡以及反擊免疫細胞使 T 細胞凋亡，是腫瘤細胞免疫逃逸的重要機制之一。本課題通過對肝癌細胞株HepG2.2.15的Fas、FasL及其功能的檢測，探討肝癌細胞通過Fas/FasL途徑的免疫逃逸機制；并通過分析肝癌組織細胞Fas-670位點基因多態(tài)性，探究肝癌細胞Fas表達低下的原因；通過將FasL反義寡脫氧核苷酸(ASODN)轉染入肝

2、癌細胞及將Fas ASODN轉染入T 細胞，研究Fas、FasL ASODN抑制肝癌細胞誘導的 T 細胞凋亡，逆轉肝癌細胞免疫逃逸的作用機制；通過干擾素．a上調肝癌細胞 Fas 表達，研究細胞因子對腫瘤細胞凋亡的促進作用。 方法：(1)流式細胞術(FCM)檢測肝癌細胞HepG2.2.15表面 Fas 及FasL的表達；(2)用激活性 Fas 單抗 CHll 誘導細胞凋亡的方法研究肝癌細胞對 Fas 介導凋亡的抵抗；(3)用Hep

3、G2.2.15細胞與 Jurkat 細胞共培養(yǎng)法研究肝癌細胞表面 FasL 誘導 T 細胞凋亡的機制。(4)用PCR-RFLP法分析肝癌組織細胞Fas-670位點的基因多態(tài)性。(5)根據(jù) Fas 及 FasL 基因序列設計合成特異的互補于 mRNA 起始密碼區(qū)的 Fas 及 FasL ASODN，并設同長度的與 mRNA 起始密碼區(qū)序列相同的正義寡脫氧核苷酸(SODN)做對照，均經硫代磷酸化修飾。根據(jù)預實驗結果，選擇120nmol/L、

4、200nmol/L、280nmol/L為轉染液的終濃度，通過脂質體介導法轉導FasL ASODN) 入 HepG2.2.15細胞，F(xiàn)CM檢測轉導后細胞表面FasL表達的變化，逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測細胞FasL mRNA的變化，用與Jurkat細胞共培養(yǎng)法檢測肝癌細胞誘導T細胞凋亡的變化，用CH11誘導細胞凋亡的方法檢測肝癌細胞凋亡的變化。用同樣的方法轉導Fas ASODN入Jurkat細胞，并檢測轉染后，Jurkat

5、細胞表面Fas表達、Fas mRNA的表達、以及與肝癌細胞共培養(yǎng)后凋亡率的變化。(6)針對肝癌細胞低表達Fas并抵抗Fas介導的凋亡，用干擾素-α(IFN-α)上調細胞Fas表達，用CH11誘導細胞凋亡的方法檢測肝癌細胞凋亡的變化。 結果： 第一部分：人肝癌細胞株HepG2.2.15 Fas/FasL的功能與免疫逃逸機制 肝癌細胞株HepG2.2.15細胞表面Fas表達率為1.24％；用激活性Fas單抗CH11誘導細

6、胞凋亡的方法顯示，HepG2.2.15細胞加入CH11后的凋亡率與加入同型對照IgM的陰性對照組比較無明顯差異，而作為陽性對照組的Jurkat細胞加入CH11后，其凋亡率卻顯著增高；且實驗組繼發(fā)性死細胞數(shù)明顯低于陽性對照組。HepG2.2.15細胞FasL的表達率為18.03％，與Jurkat細胞共培養(yǎng)可誘導Jurkat細胞凋亡，凋亡率為21.41％：用FasL中和抗體NOK-2封閉HepG2.2.15細胞表面的FasL后，Jurkat

7、細胞的凋亡率下降至8.91％。 第二部分：肝癌組織Fas啟動區(qū)-670位點基因多態(tài)性分析 Fas啟動區(qū)-670位點對照組以AA基因型最多，而肝癌組以AG基因型最多；肝癌組AA基因型頻率較對照組明顯減低，AG基因型頻率明顯增高，GG基因型頻率有增高趨勢，但尚無統(tǒng)計學意義。肝癌組Fas-670位點G等位基因頻率與對照組比較顯著增高，A等位基因頻率顯著降低；肝癌組Fas-670位點G等位基因攜帶者頻率較對照組顯著增高。

8、 第三部分：FasL、Fas反義寡核苷酸轉導對肝癌細胞誘導T細胞凋亡的抑制作用 經FasL ASODN作用48h后HepG2.2.15細胞FasL的表達率下降，F(xiàn)asL ASODN濃度為120nmol/L、200nmol/L、280nmol/L的處理組FasL的表達率分別為13.07％、7.94％、5.54％，與對照組18.06％相比均有顯著差異；且FasL表達率隨ASODN濃度的增加而下降，呈劑量相關性。而相應濃度Fas

9、L SODN處理組FasL表達率與對照組比較均無顯著差異。HepG2.2.15細胞經FasL ASODN作用后FasL mRNA水平下降，電泳圖像示條帶變淺，以β-actin基因作內參照，ASODN組FasLmRNA的相對表達量為0.3433，而對照組及SODN組分別為0.8023、0.8512。HepG2.2.15細胞經FasL ASODN作用后，與Jurkat細胞共培養(yǎng)，Jurkat細胞凋亡率下降為11.04％，與對照組21.81％

10、比較有顯著差異；而SODN組Jurkat細胞凋亡率為21.55％，與對照組比較無顯著差異。但是，HepG2.2.15細胞經FasL ASODN作用后，用CH11誘導細胞凋亡，凋亡率與對照組相比無明顯變化。 經Fas ASODN作用后Jurkat細胞Fas的表達率下降，F(xiàn)as ASODN濃度為120nmol/L、200nmol/L、280nmol/L的處理組Fas的表達率分別為63.28％、51.53％、46.94％，與對照組87.

11、23％相比均有顯著差異；且Fas表達率隨ASODN濃度的增加而下降，呈劑量相關性。而相應濃度Fas SODN處理組Fas表達率與對照組比較均無顯著差異。Jurkat細胞經Fas ASODN作用后Fas mRNA水平下降，電泳圖像示條帶變淺，以β-actin基因作內參照，ASODN組Fas mRNA的相對表達系數(shù)為0.4229，而對照組及SODN組分別為0.8540、0.9616。Jurkat細胞經FasASODN作用后，與HepG2.2

12、.15細胞共培養(yǎng)，細胞凋亡率下降為14.28％，與對照組22.17％比較有顯著差異；而SODN組Jurkat細胞凋亡率為20.94％，與對照組比較無顯著差異。 第四部分：細胞因子IFN-α對肝癌細胞Fas表達及凋亡的影響 HepG2.2.15細胞與IFN-α作用24h后Fas表達率明顯增加，IFN-α濃度分別為2000U/ml、1000U/ml、500U/ml的A1、A2、A3三組Fas表達率分別為22.02％、l8.1

13、2％、15.04％，與對照組1.71％比較均有顯著差異；且Fas表達率隨IFN-α濃度的降低而降低。加入CHll后，實驗組細胞凋亡率均明顯增加，A1、A2、A3三組分別為l7.26％、16.16％、12.02％，與對照組5.86％比較有顯著差異，且隨IFN-α濃度的降低而降低。 結論： 1．HepG2.2.15細胞Fas表達低下，能抵抗FasL誘導的凋亡。 2．HepG2.2.15細胞表達有功能的FasL，可

14、反向誘導Jurkat細胞凋亡，從而抑制T細胞的免疫功能。 3．Fas/FasL途徑是肝癌細胞免疫逃逸的重要機制之一，可成為免疫治療的新靶點。 4．肝癌組織Fas基因啟動區(qū)-670位點AA型減少、AG型增高、G等位基因頻率及G等位基因攜帶者頻率增高，提示該位點A→G替換可能是肝癌Fas表達低下的原因之一，還可能是肝癌的易感因素。 5．HepG2.2.15細胞轉導FasL A SODN后，F(xiàn)asL-mRNA降低；細胞

15、表面FasL表達下降；與Jurkat細胞共培養(yǎng)，Jurkat細胞的凋亡率下降。提示FasL ASODN轉導可有效地封閉肝癌細胞FasL表達而使其誘導T細胞凋亡的能力減弱，從而逆轉肝癌細胞的免疫抑制作用。 6．Jurkat細胞轉導Fas ASODN后，F(xiàn)as-mRNA降低；細胞表面Fas表達下降；與HepG2.2.15細胞共培養(yǎng)后Jurkat細胞的凋亡率下降。提示Fas ASODN轉導可通過有效地封閉T細胞Fas表達而阻斷肝癌細胞

16、誘導的T細胞凋亡，保護免疫細胞功能，逆轉免疫抑制。 7．FasL ASODN不能直接增加肝癌細胞的凋亡，而是通過阻斷腫瘤細胞對免疫細胞的破壞，間接促進肝癌細胞的凋亡。 8．經IFN-α作用后HepG2.2.15細胞Fas表達增加；由CH11誘導的細胞凋亡增加。提示IFN-α可通過上調細胞Fas表達，促進肝癌細胞凋亡，逆轉肝癌細胞對Fas介導凋亡的抵抗。 9．Fas、FasL ASODN及IFN-α逆轉肝癌細胞免疫