CBL調(diào)節(jié)死亡受體在脂筏內(nèi)重新分布參與奧沙利鉑增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡.pdf

1、目的： 胃癌是世界范圍內(nèi)最常發(fā)生的惡性腫瘤之一，在亞洲國家是腫瘤死亡的主要原因。多數(shù)患者在診斷時已經(jīng)是進(jìn)展期或發(fā)生轉(zhuǎn)移，5年生存率只有10％—15％?；熓侵委熗砥谖赴┑闹饕侄?。盡管化療藥物的應(yīng)用使晚期病人的生存期有所延長，但中位總生存時間很難超過12個月。生物治療有選擇性治療惡性腫瘤的潛力，因此具有很好的治療前景。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)是腫瘤壞死因子家族的成員之一。在體外研究中，TRAIL誘導(dǎo)許多腫瘤細(xì)胞

2、的凋亡，對多數(shù)正常細(xì)胞沒有毒性。但胃癌細(xì)胞對TRAIL相對不敏感。 TRAIL誘導(dǎo)的凋亡信號傳遞需要結(jié)合死亡受體4(DR4)和死亡受體5(DR5)。TRAIL與DR4和DR5結(jié)合后導(dǎo)致受體聚集，并募集Fas相關(guān)蛋白死亡結(jié)構(gòu)域(FADD)和前caspase—8、前caspase—10，共同形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物(DISC)。DISC的形成促發(fā)下游效應(yīng)物caspase并誘導(dǎo)凋亡。脂筏能為死亡受體聚集提供膜交換平臺。最近的研究表明脂

3、筏在啟動死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)時發(fā)揮了重要作用。這些結(jié)果提示脂筏功能的失調(diào)也許是胃癌對TRAIL不敏感的原因之一。 某些化療藥物，比如表阿霉素、紫杉醇、順鉑，能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對TRAIL的敏感性。奧沙利鉑是第三代含鉑藥物，奧沙利鉑為基礎(chǔ)的化療方案對胃癌的療效優(yōu)于順鉑為基礎(chǔ)的方案。有研究報(bào)道順鉑通過促進(jìn)脂筏聚集增強(qiáng)了結(jié)腸癌細(xì)胞對Fas配體的敏感性。是否奧沙利鉑能通過調(diào)節(jié)脂筏從而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對TRAIL的敏感性還不清楚。 脂筏的功能受

4、多種因素的調(diào)節(jié)。泛素連接酶Cbl家族是重要的調(diào)節(jié)因素。Cbl蛋白包括3個同源體，c—Cbl，Cbl—b和Cbl—3。c—Cbl和Cbl—b有相似的結(jié)構(gòu)和功能。有研究報(bào)告c—Cbl和Cbl—b能夠從T細(xì)胞和肥大細(xì)胞的脂筏中清除信號分子，導(dǎo)致脂筏無效聚集。此外，T細(xì)胞Cbl—b的缺失能促進(jìn)抗原誘導(dǎo)的受體聚集和脂筏聚集。但是c—Cbl和Cbl—b是否能調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的脂筏，并因此影響胃癌細(xì)胞對TRAIL的敏感性尚不明確。 為增強(qiáng)胃癌細(xì)胞

5、對TRAIL的敏感性，我們將奧沙利鉑和TRAIL聯(lián)合應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)以人胃癌細(xì)胞株MGC803，BGC823，SGC7901為模型，對脂筏在奧沙利鉑和TRAIL聯(lián)合誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中的作用進(jìn)行了研究，同時對脂筏聚集的調(diào)節(jié)因子c—Cbl和Cbl—b在此過程中的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了初步探討。 材料與方法： 1、采用MTT法測定細(xì)胞活力。 2、采用流式細(xì)胞儀通過PI—Annexin V染色進(jìn)行細(xì)胞凋亡判定。 3、采用流式

6、細(xì)胞儀通過DiOC6染色進(jìn)行線粒體跨膜電位測定。 4、采用Western blot檢測c—Cbl，Cbl—b，caspase—3，caspase—8，Bax，Bcl—2蛋白的表達(dá)。 5、采用免疫熒光顯微技術(shù)觀察細(xì)胞膜脂筏和死亡受體的分布。 6、采用Lipofectamine2000試劑進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組間差異采用Student's t test分析。P

7、<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、在MGC803，BGC823和SGC7901細(xì)胞中，100ng/mL的TRAIL導(dǎo)致輕度的增殖抑制，誘導(dǎo)不超過6％的細(xì)胞凋亡。奧沙利鉑在MGC803，BGC823和SGC7901細(xì)胞中24h抑制細(xì)胞增殖50％的藥物濃度(IC50)分別是22.56±6.55，37.47±7.67和33.92±8.01μg/mL。與單藥奧沙利鉑和TRAIL相比，奧沙利鉑(各自的IC50劑量)聯(lián)合TR

8、AIL(100ng/mL)引起明顯的細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞凋亡。當(dāng)奧沙利鉑和TRAIL聯(lián)合作用MGC803細(xì)胞后，可以見到更明顯的線粒體跨膜電位下降，caspase—3和caspase—8裂解，Bcl—2表達(dá)下調(diào)。5—FU和TRAIL協(xié)同誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡已有報(bào)道，在本實(shí)驗(yàn)中作為陽性對照。5—FU作用MGC803細(xì)胞48h抑制細(xì)胞增殖50％的藥物濃度(IC50)是2.07±1.14μg/mL。與單藥5—FU和TRAIL相比，5—FU(48h的

9、IC50劑量)聯(lián)合TRAIL(100ng/mL)引起明顯的細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞凋亡。當(dāng)5—FU和TRAIL聯(lián)合作用MGC803細(xì)胞后，可以見到更明顯的線粒體跨膜電位下降，caspase—3和caspase—8裂解，Bcl—2表達(dá)下調(diào)。 2、與對照組相比，100 ng/mL TRAIL作用MGC803細(xì)胞沒有引起明顯的脂筏聚集和DR4，DR5聚集。但是22.56μg/mL奧沙利鉑明顯促進(jìn)DR4和DR5在聚集脂筏內(nèi)的定位。奧沙利鉑和T

10、RAIL聯(lián)合作用與奧沙利鉑單藥相比，引起脂筏和死亡受體共聚集的程度相似。 3、制霉菌素是一種膽固醇分離劑能破壞脂筏。用50μg/mL制霉菌素預(yù)處理MGC803細(xì)胞1h，部分阻止了奧沙利鉑引起的脂筏聚集和DR4，DR5聚集。制霉菌素處理MGC803細(xì)胞24h后引起了少量的細(xì)胞凋亡。加入奧沙利鉑前用制霉菌素預(yù)處理1h，有減少奧沙利鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的趨勢。此外，加入奧沙利鉑和TRAIL前用制霉菌素預(yù)處理1h，凋亡細(xì)胞的比率由41.79±

11、5.48％減少到29.52±3.99％。 4、22.56μg/mL奧沙利鉑作用MGC803細(xì)胞8h后輕度抑制了c—Cbl和Cbl—b的表達(dá)，處理16h和24h后明顯減少了c—Cbl和Cbl—b的表達(dá)。100ng/mL TRAIL作用MGC803細(xì)胞16h沒有改變c—Cbl的表達(dá)，但輕度上調(diào)了Cbl—b的表達(dá)。奧沙利鉑和TRAIL聯(lián)合作用MGC803細(xì)胞16h后，下調(diào)c—Cbl和Cbl—b的程度與單藥奧沙利鉑下調(diào)的程度相似。

12、 5、使用Lipo2000瞬時轉(zhuǎn)染野生型c—Cbl和Cbl—b的表達(dá)載體進(jìn)入MGC803細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后用Western blot的方法證實(shí)c—Cbl和Cbl—b的表達(dá)量提高。與陰性對照相比，在c—Cbl，Cbl—b，c—Cbl聯(lián)合Cbl—b轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，奧沙利鉑，奧沙利鉑+TRAIL誘導(dǎo)的MGC803細(xì)胞脂筏聚集被部分抑制。 結(jié)論： 1、奧沙利鉑增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的MGC803，BGC823和SGC7901細(xì)胞凋亡

13、。在協(xié)同作用中有更明顯的線粒體跨膜電位下降，caspase—3和caspase—8裂解，Bcl—2表達(dá)下調(diào)。5—FU和TRAIL作用胃癌細(xì)胞后也有相似的結(jié)果。 2、奧沙利鉑促進(jìn)MGC803細(xì)胞的DR4和DR5募集在聚集的脂筏內(nèi)。 3、制霉菌素部分阻止了奧沙利鉑誘導(dǎo)的脂筏聚集和DR4，DR5聚集，并減少了奧沙利鉑和TRAIL誘導(dǎo)的MGC803細(xì)胞凋亡。 4、在MGC803細(xì)胞內(nèi)，奧沙利鉑下調(diào)了c—Cbl和Cbl—b