阿爾茨海默病小鼠模型中骨髓間充質(zhì)干細胞的神經(jīng)分化.pdf

1、背景和目的：
　　阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease，AD)是老年人癡呆常見的類型，病理特征主要為老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、海馬椎體細胞顆?？张葑冃约吧窠?jīng)元缺失。主要臨床特征是進行性智能減退，多伴有人格改變，并且發(fā)病率隨年齡逐漸增高。阿爾茨海默病協(xié)會統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示:在美國約有520萬AD患者，其中年齡小于65歲的AD患者約有20萬，其余500萬AD患者年齡均在65歲之上。隨著生育高峰期的出現(xiàn)，在接下來的幾十年將有約1

2、000萬美國人新發(fā)展為AD。目前在美國約每68秒就有一人發(fā)展為AD患者，預(yù)計到2050年，AD的發(fā)病頻率將有所增加，約每33秒就有一人發(fā)展為AD患者。在美國，AD是所有致死原因的第六位，而在年齡65歲以上（包括65歲）的人中，AD排在第五位。在過去的十年中，由心臟疾病、卒中和前列腺癌所導(dǎo)致死亡人數(shù)的比例分別下降16％、23％和8％，而AD所致死亡人數(shù)的比例增加了約68％。AD除了給患者本人帶來了嚴重的健康問題、生活質(zhì)量和工作能力的下降，

3、也給其家人帶來了嚴峻的考驗，除了需要花費人力對AD患者進行專心的看護外，昂貴的經(jīng)濟費用也讓很多家庭難以承受。但AD的病因迄今不明，發(fā)病的具體機制也不十分清楚。目前尚無特效的治療方法可以逆轉(zhuǎn)或阻止AD的發(fā)展。即使給予治療，患者病情仍會逐漸進展。因此，如果想要改變AD現(xiàn)在的情況，則急需研究出新的有效的治療方案。現(xiàn)有的研究表明，骨髓間充質(zhì)干細胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)在一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病如神經(jīng)退行

4、性疾病的治療中發(fā)揮作用。自體骨髓間充質(zhì)干細胞，因具有易獲得和沒有免疫排斥反應(yīng)的特點，可能成為細胞移植的極好選擇。但是廣泛存在的Notch1信號通路能夠抑制干細胞的神經(jīng)分化，Notch1與AD特異性蛋白APP被同一種酶水解，在AD患者MSCs神經(jīng)分化過程中是否存在Notch1和APP的交互作用，尚不清楚。此外，自噬是一種通過非選擇性溶酶體途徑的自我降解過程，是神經(jīng)元生理功能維持必需的，在AD中發(fā)揮重要作用。但是，在AD患者進行自體MSCs

5、移植后，自體同源MSCs神經(jīng)分化過程是否存在自噬缺陷仍未可知。因此，通過自體骨髓間充質(zhì)干細胞移植來治療AD，這一方案能否取得決定性的勝利還是一個未知數(shù)。
　　骨髓間充質(zhì)干細胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)是骨髓組織中的一種基質(zhì)細胞，由Friedenstein在細胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)的一種梭形細胞。在骨髓組織中，MSCs的數(shù)量不是很多，但其在造血干細胞的存活和功能維持等方面起重要作用。除此之外，MS

6、Cs還是一種擁有自我更新能力和多向分化潛能的細胞。MSCs能夠分化為不同的細胞，比如可以向骨細胞、軟骨細胞、心肌細胞、脂肪細胞和神經(jīng)細胞等分化。目前研究的MSCs多來源于骨髓、脂肪組織和臍帶血等組織。MSCs的多向分化潛能使其在眾多疾病的診治中占有重要地位。特別是在神經(jīng)系統(tǒng)病變中，如神經(jīng)退行性病變和缺血缺氧性腦病等疾病，MSCs為其新的有效的治療帶來了希望。目前雖然認為自體MSCs移植可能是一種安全有效的方法，但是，MSCs向神經(jīng)細胞橫

7、向分化的過程中仍存在許多問題，需要進一步深入研究。
　　因此本實驗通過建立阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠模型（APP轉(zhuǎn)基因小鼠），來觀察體外誘導(dǎo)AD小鼠模型的MSCs的神經(jīng)分化特點，從而探討其與調(diào)節(jié)干細胞分化的Notch1信號通路的關(guān)系，并觀察分化后的MSCs中自噬的變化情況。
　　材料和方法：
　　建立APP轉(zhuǎn)基因小鼠模型。體外培養(yǎng)小鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞。實驗分為兩組:APP組（即MSCs取自APP轉(zhuǎn)基因小鼠）和WT組（即M

8、SCs取自野生型小鼠）。采用β-巰基乙醇誘導(dǎo)小鼠MSCs分化為神經(jīng)細胞;采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測誘導(dǎo)后β淀粉樣蛋白40(Aβ40)和42(Aβ42)的水平;采用免疫細胞化學(xué)染色法和Western blot檢測神經(jīng)標志蛋白神經(jīng)元烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)微管結(jié)合蛋白(MAP-2)的表達變化;Western blot檢測Notch1信號通路各節(jié)點分子Notch-1、Notch細胞內(nèi)片段(NICD)和Hes5的水平及誘導(dǎo)分化后自噬的

9、特異性標記物微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)的表達變化。在誘導(dǎo)分化完成后，采用雷帕霉素誘導(dǎo)自噬，并用Western blot分析不同時間點自噬選擇性底物P62的水平。
　　結(jié)果：
　　1.β-巰基乙醇可以誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元分化，其中以APP組最佳，神經(jīng)標志蛋白神經(jīng)元烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)微管結(jié)合蛋白（MAP-2）顯著高于WT組(P＜0.05)。
　　2.誘導(dǎo)分化后，APP組骨髓間充質(zhì)干細胞有更強Aβ表達能力，在

10、APP組誘導(dǎo)培養(yǎng)液中可檢測到Aβ40和Aβ42的濃度分別是(23.2±3.5)ng/L，（3.3±0.6）ng/L，而在WT組的誘導(dǎo)培養(yǎng)液中未檢測到。
　　3.誘導(dǎo)分化前，APP組Notch1信號通路活性低于WT組，APP組骨髓間充質(zhì)干細胞中Notch1信號通路各節(jié)點分子Notch-1、NICD和Hes5的表達顯著低于WT組(P＜0.05)。誘導(dǎo)分化后，兩組Notch1信號通路均受到抑制，以APP組更甚。兩組骨髓間充質(zhì)干細胞中No

11、tch-1、NICD和Hes5的表達均低于誘導(dǎo)前，且APP組顯著低于WT組(P＜0.05)。
　　4.誘導(dǎo)后，可見LC3陽性熒光點的聚集，APP組骨髓間充質(zhì)干細胞中自噬標志物L(fēng)C3-Ⅱ表達顯著高于WT組。自噬誘導(dǎo)前后APP組MSCs中自噬選擇性底物P62的水平無明顯改變，但顯著高于WT組(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　過表達APP可能通過抑制Notch1信號通路增強小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的神經(jīng)分化能力，而分化后的AP