乙型肝炎重癥化過程中microRNA-210的改變及功能研究.pdf

1、研究目的：
　　乙型重型肝炎病死率高，預(yù)后差。尋找可用于早期預(yù)示和早期診斷重型肝炎發(fā)生的分子標(biāo)志物是目前病毒性肝炎研究的熱點(diǎn)之一。越來越多的證據(jù)表明循環(huán)microRNAs(cir-miRNAs)可能作為潛在的疾病診斷生物標(biāo)志物。本課題旨在研究乙型肝炎重癥化過程中血清miRNA表達(dá)譜的變化以篩選差異表達(dá)的microRNA-210（miRNA-210）、評(píng)價(jià)血清miR-210水平與乙型肝炎重癥化進(jìn)程的關(guān)聯(lián)關(guān)系、探討miR-210在乙型

2、肝炎重癥化過程中的潛在功能及其作用機(jī)制，為乙型肝炎重癥化的早期預(yù)測(cè)、預(yù)防和治療提供新型靶標(biāo)。
　　研究方法：
　　1 miRNA芯片實(shí)驗(yàn)
　　(1) miRNA表達(dá)譜分析:
　　用TaqMan(R) Human MicroRNA Array A分析健康人混合血清樣本（10例等體積混合）、慢乙肝輕度病人混合血清樣本（10例等體積混合）、乙型慢加急肝衰竭病人混合血清樣本（10例等體積混合）的miRNAs表達(dá)譜。

3、>　　(2)篩選差異表達(dá)miRNAs:
　　以(Ct＜35)且(|△△Ct|≥2)為判定標(biāo)準(zhǔn)，初步篩選可擴(kuò)增檢測(cè)到的差異表達(dá)的miRNAs。
　　(3)候選miR-210的選擇:
　　以(Ct＜35)且(△△Ct≤-2)為判定標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步篩選隨著乙型肝炎病情嚴(yán)重程度表達(dá)水平升高的miR-210用于單樣本RT-qPCR驗(yàn)證。
　　2人群調(diào)查
　　(1)血清樣本:
　　30例慢乙肝輕度病人血清、30例慢乙

4、肝重度病人血清、30例乙型慢加急肝衰竭病人血清及30例健康對(duì)照血清。
　　(2) miR-210的再驗(yàn)證:
　　針對(duì)miRNA芯片篩選出來的差異表達(dá)的miR-210進(jìn)行單樣本RT-qPCR驗(yàn)證。
　　(3)其他檢測(cè)指標(biāo):
　　肝功能(ALT、AST、TBIL、PTA)，血清HBV標(biāo)記物，病毒載量。
　　3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　經(jīng)小鼠尾靜脈注射Con A(20 mg/kg)制備小鼠急性肝衰竭模型，并于注射后6、

5、12、24小時(shí)處死動(dòng)物，收集外周血和肝組織，檢測(cè)下列指標(biāo):
　　(1)缺氧探針染色:檢測(cè)缺氧肝細(xì)胞。
　　(2)熒光定量PCR:檢測(cè)肝組織和血清miR-210水平。
　　(3)熒光定量PCR:檢測(cè)小鼠肝組織miR-210靶基因Iscu、Ndufa4、Sdhd、Gpd11和Cox10 mRNA水平。
　　4.體外實(shí)驗(yàn)
　　HepG2.2.15細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染空白對(duì)照（DEPC水）、模擬物陰性對(duì)照和miR-210模

6、擬物后，缺氧培養(yǎng)24 h或48 h后檢測(cè)下列指標(biāo):
　　(1) CCK8 assay:檢測(cè)HepG2.2.15細(xì)胞線粒體脫氫酶活性。
　　(2)病毒學(xué)指標(biāo)檢測(cè):培養(yǎng)基上清HBsAg、HBeAg、HBV DNA拷貝數(shù);HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBsAg mRNA水平。
　　研究結(jié)果：
　　1 miRNA芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　(1)血清中可檢測(cè)到miRNA的數(shù)量和表達(dá)水平隨著病情進(jìn)展顯著增加。
　　(2)乙

7、型肝炎病人血清let-7b等20個(gè)miRNAs表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組。
　　(3)血清中miR-210、miR-324-5p、miR-423-5p表達(dá)水平隨著病情進(jìn)展顯著升高。
　　2人群調(diào)查結(jié)果
　　(1)輕/重度乙型肝炎和乙型慢加急肝衰竭病人血清中miR-210的水平顯著高于健康對(duì)照組(P＜0.05)，血清中miR-210表達(dá)水平隨著乙型肝炎病情進(jìn)展顯著性升高。
　　(2)慢性乙型肝炎患者血清miR-21

8、0水平與ALT/AST水平及血清總膽紅素水平呈正相關(guān)(P＜0.05)，與凝血酶原活動(dòng)度呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。
　　3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　(1)小鼠肝衰竭進(jìn)程存在動(dòng)態(tài)缺氧現(xiàn)象。ConA暴露6h組和12h組小鼠肝細(xì)胞缺氧率顯著性增加(P＜0.05)，Con A暴露24 h組小鼠肝細(xì)胞缺氧率顯著高于0h組(P＜0.05)，但低于6h和12h組（P＜0.05）。
　　(2)小鼠肝組織和血清miR-210表達(dá)水平隨著病情進(jìn)展顯

9、著升高。
　　(3)小鼠肝衰竭進(jìn)程miR-210靶基因Iscu、Ndufa4、Sdhd、Gpd11和Cox10mRNA表達(dá)水平顯著性減少（P＜0.05）。
　　4細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　(1)缺氧條件下miR-210過表達(dá)抑制HepG2.2.15細(xì)胞線粒體脫氫酶活性。
　　(2)缺氧條件下miR-210過表達(dá)抑制HBV DNA復(fù)制和HBsAg表達(dá)。
　　研究結(jié)論：
　　1.miRNA表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示:乙型