手性釕配合物Λ-WH0402抗瘤活性及其機制的實驗研究.pdf

1、順鉑是全球三大抗腫瘤藥物之一,它的廣泛使用奠定了對金屬抗腫瘤藥物的肯定,釕配合物具有與鉑相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì),被認(rèn)為是最有前途的金屬抗癌藥物之一。由于順鉑嚴(yán)重的毒副作用,促使人們開始關(guān)注并研究與鉑具有相近抗腫瘤活性的金屬釕配合物。
　　 近年來,大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)釕配合物有低毒性、易吸收并可很快排泄的特點,由于配體和金屬離子的協(xié)同作用,其藥理活性有增強的趨勢。這類化合物在腫瘤中分布濃度高說明易于被腫瘤組織吸收,并且具有與鉑類化合物更

2、佳的生物活性與更低毒性,有可能成為活性比順鉑更強的新型抗腫瘤藥物,經(jīng)過化學(xué)修飾有望成為最有前途的抗癌藥物之一。
　　 前期工作,通過設(shè)計合成不同的配體,改變輔助配體,以拆分的方法設(shè)計合成出了一系列手性釕聯(lián)吡啶和手性釕菲噦啉配合物,并對這些化合物進行了表征,同時研究其Λ－異構(gòu)體和△一異構(gòu)體,得出Λ－異構(gòu)體比△-異構(gòu)體活性強大,經(jīng)過一系列篩選,從眾多手性釕配合物中篩選出活性最好的釕配合物Λ－[Ru(bpy)2(o-tFPIP)](C

3、l)2,即Λ－WH0402。
　　 本課題從細胞生物學(xué)、實驗動物學(xué)、分子生物學(xué)、病理形態(tài)學(xué)等方面,以順鉑的抗瘤作用為對照,通過篩選Λ－WH0402敏感腫瘤細胞株,檢測Λ－WH0402對敏感腫瘤株的抗腫瘤活性；應(yīng)用抗腫瘤轉(zhuǎn)移、抑制血管作用等實驗,研究了手性釕配合物Λ－WH0402的抗腫瘤活性作用,并對其作用機制進行初步探討。
　　 方法
　　 1.通過MTT法篩選對Λ－WH0402敏感的腫瘤細胞株,并以順鉑為對照,

4、通過體內(nèi)外實驗驗證Λ－WH0402的療效與毒性,確定對Λ－WH0402進行研究的必要性。
　　 2.通過細胞爬片觀察、掃描電鏡觀察、腫瘤細胞生長曲線觀察、裸鼠體內(nèi)成瘤實驗觀察Λ－WH0402對敏感腫瘤株生長的抑制作用；通過流式細胞實驗、熒光顯微鏡觀察、凋亡蛋白檢測觀察Λ-WH0402對敏感腫瘤株誘導(dǎo)凋亡的作用,分析Λ-WH0402對敏感腫瘤株的抗腫瘤活性作用機制。
　　 3.Λ-WH0402敏感腫瘤細胞株HCCLM6為高

5、轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細胞株,通過體外侵襲、運動、粘附實驗,體內(nèi)原位移植轉(zhuǎn)移實驗,觀察Λ-WH0402對腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。
　　 4.通過Λ-WH0402對人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC的MTT實驗、內(nèi)皮細胞遷移實驗、實驗性體內(nèi)血道肺轉(zhuǎn)移的影響,觀察Λ-WH0402對腫瘤血管的抑制作用。
　　 結(jié)果
　　 1.體外應(yīng)用MTT生長曲線動態(tài)分析,對10種人腫瘤細胞株進行篩選,獲得Λ-WH0402敏感腫瘤株為肝細胞癌高轉(zhuǎn)移腫瘤

6、細胞株HCCLM6。
　　 2.通過體外MTT實驗,體內(nèi)裸鼠及C57小鼠實驗,結(jié)果顯示Λ-WH0402的療效與順鉑接近,兩者之間差異無顯著性(P=0.028)；急性毒性結(jié)果顯示,Λ-WH0402的LD50為11.66 mg/kg。
　　 3.倒置顯微鏡觀察、細胞爬片觀察、掃描電鏡觀察,結(jié)果顯示對照組HCCLM6細胞生長狀態(tài)良好,實驗組隨Λ-WH0402劑量增加或培養(yǎng)時間的延長,細胞狀態(tài)逐漸惡化,生長明顯受到抑制。流式細胞

7、儀檢測細胞周期分布,結(jié)果顯示當(dāng)濃度達0.312μg/ml作用24h、48 h后,細胞周期主要阻滯在G0/G1期,當(dāng)濃度達0.625、1.25μg/ml作用24h、48h后,細胞周期主要阻滯在S期。流式細胞儀、熒光染色、凋亡蛋白檢測,結(jié)果顯示Λ-WH0402能夠誘導(dǎo)HCCLM6細胞凋亡。
　　 4.體內(nèi)裸鼠實驗,在裸鼠右側(cè)脅部皮下接種1×106、左側(cè)接種2×105 HCCLM6細胞,建立雙側(cè)腫瘤小鼠模型,成瘤后次日在左側(cè)腫瘤皮下注

8、射生理鹽水,右側(cè)腫瘤的皮下注射水溶性Λ-WH0402,結(jié)果用雙因素方差分析得出,Λ-WH0402用藥組與未用藥組裸鼠移植瘤體積,有顯著性差異(F=20.242,P=0.001),瘤重用獨立樣本T檢驗,組間的瘤重有顯著性差異(t=9.363,P=0.000),Λ-WH0402具有抑制HCCLM6裸鼠成瘤作用。
　　 5.體外侵襲、粘附、運動實驗結(jié)果顯示,Λ-WH0402能夠在體外抑制HCCLM6細胞的侵襲粘附及運動能力；動物體內(nèi)原

9、位移植實驗結(jié)果表明,Λ-WH0402能夠在裸鼠體內(nèi)明顯抑制原位移植后肝、肺、腹腔和腹壁轉(zhuǎn)移。
　　 6.內(nèi)皮細胞的MTT實驗結(jié)果表明,Λ-WH0402對內(nèi)皮細胞增殖的抑制作用高于其敏感株HCCLM6細胞；內(nèi)皮細胞遷移實驗表明,Λ-WH0402能夠抑制內(nèi)皮細胞的遷移；小鼠體內(nèi)實驗性血道肺轉(zhuǎn)移實驗顯示,Λ-WH0402用藥組較對照組肺轉(zhuǎn)移動物數(shù)(x2=4.000 P=0.046)、肺轉(zhuǎn)移率、肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)(t=-6.357 P=0.0

10、00)明顯減少。
　　 結(jié)論
　　 1.應(yīng)用10株人腫瘤細胞株進行增殖活性篩選,得出肝細胞癌高轉(zhuǎn)移細胞株HCCLM6是Λ-WH0402的敏感腫瘤細胞株。與順鉑相比較,Λ-WH0402抗瘤活性及急性毒性與順鉑接近。
　　 2.Λ-WH0402通過阻滯細胞的DNA合成、抑制S期→G2期的轉(zhuǎn)化而抑制HCCLM6細胞的生長,通過上調(diào)P53和Bax的表達,下調(diào)Bcl-2的表達而誘導(dǎo)HCCLM6細胞的凋亡。
　　 3

11、.Λ-WH0402抑制HCCLM6的體外粘附、侵襲及運動能力,在體內(nèi)抑制肝細胞癌的實驗性轉(zhuǎn)移能力。
　　 4.Λ-WH0402對內(nèi)皮細胞HUVEC增殖抑制作用高于HCCLM6,能夠抑制內(nèi)皮細胞的遷移,抑制小鼠體內(nèi)實驗性血道肺轉(zhuǎn)移。
　　 本研究的創(chuàng)新之處
　　 應(yīng)用 Λ-WH0402對10種人腫瘤細胞株進行體外活性篩選,發(fā)現(xiàn)Λ-WH0402對10種人腫瘤細胞株有不同程度抑瘤作用,其中肝細胞癌高轉(zhuǎn)移細胞株HCCLM