廣州市五所醫(yī)院銅綠假單胞菌耐藥現(xiàn)狀和危險(xiǎn)因素及其分子特征研究.pdf

1、目的：了解廣州市部分醫(yī)院銅綠假單胞菌不同耐藥程度流行情況及其危險(xiǎn)因素;探究不同耐藥程度銅綠假單胞菌β-內(nèi)酰胺酶、基因的分布和基因分型狀況及其可能的耐藥機(jī)制。
　　方法：收集2008年7月到2012年12月在廣州某五所醫(yī)院院內(nèi)感染患者的銅綠假單胞菌348株,經(jīng)鑒定后,采用回顧性查閱病例方法收集病史資料。348株P(guān)A進(jìn)行藥敏試驗(yàn)后,篩選敏感菌株、1-2類耐藥菌株、多重耐藥菌株及泛耐藥菌株,分析其耐藥現(xiàn)況及通過(guò)單因素和多因素采用無(wú)序多分

2、類logistic回歸分析1-2類耐藥菌株、多重耐藥菌株及泛耐藥菌株感染的危險(xiǎn)因素。
　　運(yùn)用雙紙片復(fù)合法和雙紙片協(xié)同法篩選PA產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶(超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、金屬酶、AmpC酶)的情況,同時(shí)運(yùn)用PCR擴(kuò)增β-內(nèi)酰胺酶的編碼基因(NDM-1、TEM、PER、OXA-10、IMP、VIM)、氨基糖苷類鈍化酶編碼基因(ant(3″)-Ⅰ與aac(6′)-Ⅱ)、外膜孔蛋白Oprd2,整合子及gyrA、parC管家基因,然后運(yùn)用PCR

3、-RFLP的方法對(duì)整合子進(jìn)行分型及檢測(cè)gyrA、parC管家基因的QRDR片段的突變情況。最后分析五所醫(yī)院感染菌株的β-內(nèi)酰胺酶、耐藥基因及管家基因突變的情況,并運(yùn)用卡方檢驗(yàn)分析β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生、耐藥基因或管家基因突變與耐藥菌株(包括1-2類耐藥組、多重耐藥組、泛耐藥組菌株)的關(guān)系。
　　采用脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法對(duì)銅綠假單胞菌菌株進(jìn)行分子分型,并運(yùn)用Bionumerie 6.0軟件進(jìn)行聚類分析,分析菌株間的親緣關(guān)系及鑒定散發(fā)或暴發(fā)流

4、行趨勢(shì)。
　　結(jié)果：2008年-2012年間共收集348株銅綠假單胞菌,其中多重耐藥組中MDRPA 149例,多重耐藥率為42.8％(149/348),39株P(guān)DRPA,泛耐藥率為11.2%(39/348)。MDRPA感染的患者中男性占63.3%(114/180),中位數(shù)是73歲;PDRPA感染男性占59.0%(23/39),中位數(shù)是74歲。PDRPA主要分布在重癥加強(qiáng)護(hù)理病房(12/39),呼吸內(nèi)科(11/39)和神經(jīng)內(nèi)科(8/

5、39),MDRPA分布最多的亦為以上三個(gè)科室。MDRPA與PDRPA的標(biāo)本來(lái)源大部分來(lái)自痰,分別達(dá)81.1%(146/180)、82.1%(32/39)。PA對(duì)抗菌藥物耐藥性最高的前三位是β-內(nèi)酰胺類的TIC44.8%、PIP39.7%、ATM34.8%,敏感性最高的是MEN74.1%,13種抗菌藥物中除了LEV、ATM外,耐藥率隨著時(shí)間變化而呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。
　　單因素分析發(fā)現(xiàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素包括:手術(shù)、檢出前入住ICU

6、、使用碳青霉烯類抗菌藥物、使用二代頭孢抗菌藥物、抗菌藥物使用總天數(shù)、感染前住院天數(shù)、使用抗菌藥物≥3種、混合感染、吸痰、機(jī)械通氣、導(dǎo)尿管插管、鼻飼胃管插管。多因素分析發(fā)現(xiàn)(以敏感組為對(duì)照組):1-2類耐藥組的危險(xiǎn)因素有吸痰(調(diào)整后OR=2.79,95%CI=1.09-7.12);多重耐藥組危險(xiǎn)因素有曾使用碳青霉烯類抗菌藥物(調(diào)整后OR=2.29,95%CI=1.02-5.15),檢出前入住ICU(調(diào)整后OR=2.90,95%CI=1.2

7、2-6.91);泛耐藥組的危險(xiǎn)因素有曾使用碳青霉烯類抗菌藥物(調(diào)整后OR=5.94,95%CI=1.97-17.85)和機(jī)械通氣(調(diào)整后OR=11.78,95%CI=3.14-44.20)。
　　β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生及其編碼基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn):348株菌產(chǎn)MBL酶占11.2%(39/348),產(chǎn)AmpC酶占12.9%(45/348),ESBLs酶占12.1%(42/348);各種產(chǎn)酶率在四組分布的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。β-內(nèi)

8、酰胺酶編碼基因NDM-1暫未檢出,而TEM達(dá)43.4%(151/348),PER達(dá)22.7%(79/348),OXA-10達(dá)23.3%(81/348),IMP達(dá)15.2%(53/348),VIM達(dá)4.6%(16/348);除了PER與IMP基因外,其余耐藥基因在泛耐藥組(PDRPA)和敏感組檢出率差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　外膜通透性調(diào)控基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn):OprD2的總的缺失率達(dá)19.5%(68/348);1-2類耐藥組、多重耐藥組和

9、泛耐藥組的OprD2基因的缺失率與敏感組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其OR值分別為:1-2類耐藥組(OR=12.57,95%CI=1.65-111.37),多重耐藥組(OR=38.53,95%CI=5.21-285.19),泛耐藥組(OR=66.08,95%CI=8.33-524.24)。
　　氨基糖苷類鈍化酶編碼基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn):aac(6')-Ⅱ基因攜帶率達(dá)24.7%(86/348),ant(3”)-Ⅰ達(dá)32.2%(112/348)

10、;aac(6')-Ⅱ、ant(3”)-Ⅰ的基因的檢出率在多重耐藥組和泛耐藥組中分別與敏感組比較,得多重耐藥組中aac(6')-Ⅱ(OR=3.45,95%CI=1.68-7.07)、ant(3”)-Ⅰ(OR=3.13,95%CI=1.69-5.81),泛耐藥組中aac(6')-Ⅱ(OR=11.11,95%CI=4.54-27.19)、ant(3”)-Ⅰ(OR=3.23,95%CI=1.42-7.38),且具差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

11、。
　　整合子檢測(cè)結(jié)果:Ⅰ類整合子檢出172株,占49.4%(172/348),未檢出Ⅱ、Ⅲ類整合子;其中MDRPA的Ⅰ類整合子達(dá)53.7%(80/149)。PDRPA中Ⅰ類整合子達(dá)84.6%(33/39);慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、哌拉西林、替卡西林、亞胺培南、美羅培南、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氨曲南、頭孢他啶、頭孢吡肟12種抗菌藥物在整合子陽(yáng)性菌株中的耐藥率明顯高于整合子陰性組,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。多重耐藥組

12、、泛耐藥組的整合子的檢出率分別與敏感組比較差異,得多重耐藥組(OR=2.43,95%CI=1.43-4.15),泛耐藥組(OR=11.53,95%CI=4.37-30.40),且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　喹諾酮耐藥決定區(qū)突變情況:在162株喹諾酮耐藥的銅綠假單胞菌,gyrA基因突變占40.7%(66/162),parC突變占17.3%(28/162);gyrA基因的QRDR片段突變主要發(fā)生在第83位氨基酸密碼子的

13、ACC→ATC,其編碼的氨基酸由The→Ⅱe,與此同時(shí),耐藥菌株在132位氨基酸密碼子(CAC→CAT)有一靜止突變,該突變未引起氨基酸的改變,而parC測(cè)序結(jié)果表明QRDR片段突變主要位于第79位氨基酸密碼子發(fā)生TCC→GCC的突變,該位點(diǎn)突變引起氨基酸Ser→Ala的改變;泛耐藥組中g(shù)yrA與parC的QRDR片段的突變率與1-2類耐藥組的菌株比較,得出gyrA(OR=3.93,95%CI=1.13-13.62),parC(OR=1

14、.36,95%CI=1.11-1.16),且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　PFGE分子分型結(jié)果:348株菌Dice系數(shù)為100%的PA一共有8對(duì),分別為A、B、D、C、E、F、G、H型,PFGE為A、C、D、E、F型中同一型里兩或三位患者均來(lái)自同一家醫(yī)院,不但住院時(shí)間日期有重疊且同一個(gè)科室,加之耐藥譜相似,容易導(dǎo)致患者間互相感染的發(fā)生,因此上述5型中的同源菌株考慮科室內(nèi)交叉感染而產(chǎn)生。而B(niǎo)、G、H型的菌株同一型的患者

15、均來(lái)自同一家醫(yī)院,但檢出科室不同,有發(fā)生科室間交叉感染的可能,感染途徑還有待追究。泛耐藥株的PFGE分型Dice系數(shù)在44.3%至97.1%之間,Dice系數(shù)在80%或以上的同源株有5組,同一型的菌株均來(lái)自同一家醫(yī)院,共11株P(guān)DRPA,其余的28株均為散發(fā)。
　　結(jié)論：廣州市院內(nèi)感染PA菌株的耐藥發(fā)生率較為普遍,除了LEV和ATM外,耐藥率隨著時(shí)間呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。
　　吸痰為1-2類耐藥PA的危險(xiǎn)因素;曾使用碳青霉烯類抗菌

16、藥物、檢出前入住ICU為MDRPA的危險(xiǎn)因素;機(jī)械通氣、曾使用碳青霉烯類抗菌藥物為PDRPA的危險(xiǎn)因素。
　　β-內(nèi)酰胺酶及其基因(TEM、OXA-10、VIM)、氨基糖苷類鈍化酶編碼基因aac(6')-Ⅱ、OprD2基因的缺失、整合子、gyrA和ParC基因的喹諾酮耐藥決定區(qū)突變?yōu)镻DRPA產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制。
　　未發(fā)現(xiàn)PA大范圍單克隆流行情況,大部分菌株呈散發(fā)流行趨勢(shì),但在同醫(yī)院或病區(qū)存在輕微的克隆播散現(xiàn)象,ICU與呼