伏馬菌素B1對(duì)正常食管上皮細(xì)胞的影響及其與食管癌關(guān)系的病例對(duì)照研究.pdf

1、大量流行病學(xué)調(diào)查表明，在一些食管癌高發(fā)區(qū)居民糧食中伏馬菌素B1(FB1)的污染水平明顯高于低發(fā)區(qū)，但FB1與食管癌的關(guān)系仍缺少實(shí)驗(yàn)室的直接證據(jù)和人群病例對(duì)照研究資料。本研究采用人類(lèi)正常食管上皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，觀察FB1對(duì)人類(lèi)正常食管上皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的作用，研究FB1對(duì)人類(lèi)正常食管上皮細(xì)胞周期相關(guān)基因DNA甲基化、mRNA和蛋白表達(dá)的影響，同時(shí)在江蘇淮安食管癌高發(fā)地區(qū)選擇2007、2008及2009三年中進(jìn)行手術(shù)的食管癌病例

2、152例，以同性別、年齡相差2歲以?xún)?nèi)的正常人按1∶1配對(duì)，收集食管癌組織、癌旁組織及血液標(biāo)本，檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)基因DNA甲基化、mRNA和蛋白的表達(dá)、血清中維生素A和二氫神經(jīng)鞘氨醇/神經(jīng)鞘氨醇(sphinganine/sphingosine，Sa/So)水平，開(kāi)展病例對(duì)照研究，探討FB1在食管癌發(fā)生中的作用及其機(jī)制以驗(yàn)證體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，并分析維生素A與食管癌的關(guān)系，用體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證維生素A的干預(yù)作用，為食管癌的一級(jí)預(yù)防措施的制定提供科

3、學(xué)依據(jù)。
　　研究結(jié)果如下：
　　1.FB1對(duì)人類(lèi)正常食管上皮細(xì)胞的影響研究
　　用5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/LFB1處理人類(lèi)正常食管上皮細(xì)胞24h、48h、72h和96h，均可以促進(jìn)細(xì)胞增殖。FB1處理72h時(shí)，40μmol/FB1組GO/G1期細(xì)胞比例、細(xì)胞凋亡比例明顯低于0μmol/LFB1組(p＜0.05)，S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯高于0μmol/LFB1組(p＜0.

4、05);20μmol/LFB1組G0/G1期細(xì)胞比例明顯低于0μmol/LFB1組(p＜0.05)，S期細(xì)胞比例明顯高于0μmol/LFB1組(p＜0.05)，但G2/M期細(xì)胞比例、細(xì)胞凋亡比例與0μmol/LFB1組間無(wú)顯著差異(p＞0.05);5μmol/L、10μmol/LFB1組G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞比例、細(xì)胞凋亡比例與0μmol/LFB組間無(wú)顯著差異(p＞0.05)。
　　2.FB1對(duì)人類(lèi)正常食管上皮細(xì)胞作用

5、的分子生物學(xué)機(jī)制研究
　　用5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/LFB1處理人類(lèi)正常食管上皮細(xì)胞72h，不同劑量的FB1處理的人類(lèi)正常食管上皮細(xì)胞周期相關(guān)基因P16、P21等均未發(fā)生甲基化。10μmol/L、20μmol/L、40μmol/LFB1組均可上調(diào)CyclinD1基因的mRNA表達(dá)，下調(diào)CyclinE、P16、P21、P27基因的mRNA表達(dá);5μmol/LFB1組可上調(diào)CyclinD1基因

6、的mRNA表達(dá)，下調(diào)CyclinE、P21基因的mRNA表達(dá)，但對(duì)P16、P27基因的mRNA表達(dá)無(wú)顯著影響。20μmol/L、40μmol/LFB1組均可下調(diào)CyclinE、P21、P27基因的蛋白表達(dá)，上調(diào)CyclinD1、PKC基因的蛋白表達(dá);10μmol/LFB1組可下調(diào)CyclinE、P21、P27基因的蛋白表達(dá)，上調(diào)CyclinD1基因的蛋白表達(dá)，但對(duì)PKC基因的蛋白表達(dá)無(wú)顯著影響;而5μmol/FB1組對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)基因的

7、蛋白表達(dá)均無(wú)顯著影響。
　　3.FB1內(nèi)暴露、細(xì)胞周期相關(guān)基因DNA甲基化和mRNA表達(dá)、血清維生素A水平與食管癌關(guān)系的病例對(duì)照研究
　　食管癌病例組血清Sa水平明顯高于對(duì)照組(P＜0.001)，So水平明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)，Sa/So水平顯著高于對(duì)照組(P＜0.0001)。食管癌病例組全血樣品P16、P21基因DNA甲基化率與對(duì)照組間比較，有顯著性差異（P均＜0.001）。食管癌病例組全血樣品CyclinE、P2

8、1、P27基因mRNA表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。食管癌病例組血清中維生素A的含量明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)。用多因素logistic回歸分析結(jié)果表明，血清Sa/So水平、全血樣品P16基因甲基化是食管癌的危險(xiǎn)因素，全血樣品P21、P27基因mRNA表達(dá)、血清維生素A水平是食管癌的保護(hù)因素。
　　4.細(xì)胞周期相關(guān)基因在食管癌患者癌組織和癌旁組織中的對(duì)比研究
　　食管癌患者癌組織P16、P21基因DNA甲基化率與癌

9、旁組織比較，有顯著性差異(P＜0.001;P＜0.05)。癌組織P16、P21、P27基因mRNA表達(dá)明顯低于癌旁組織(P＜0.05)，CyclinE基因mRNA表達(dá)明顯高于癌旁組織(P＜0.05)。癌組織CyclinE、CyclinD1和PKC的蛋白表達(dá)上調(diào)，而P21、P27基因蛋白表達(dá)下調(diào)。
　　5.維生素A對(duì)FB1處理的人類(lèi)正常食管上皮細(xì)胞的干預(yù)作用研究
　　用5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μ

10、mol/L的FB1處理人類(lèi)正常食管上皮細(xì)胞同時(shí)加入10μmol/L維生素A干預(yù)24h、48h、72h和96h，其中40μmol/LFB1處理人類(lèi)正常食管上皮細(xì)胞同時(shí)加入10μmol/L維生素A干預(yù)24h、48h、72h和96h，20μmol/LFB1處理人類(lèi)正常食管上皮細(xì)胞同時(shí)加入10μmol/L維生素A干預(yù)72h和96h，維生素A均能抑制FB1的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，其余干預(yù)組對(duì)FB1促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用無(wú)顯著影響。
　　用5μmol

11、/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L的FB1處理人類(lèi)正常食管上皮細(xì)胞同時(shí)加入10μmol/L維生素A干預(yù)72h，40μmol/LFB1處理人類(lèi)正常食管上皮細(xì)胞同時(shí)加入10μmol/L維生素A干預(yù)組，維生素A能明顯改善FB1對(duì)S期阻滯和對(duì)人類(lèi)正常食管上皮細(xì)胞凋亡的抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入G2/M期，其余干預(yù)組對(duì)FB1改變細(xì)胞周期和凋亡的作用無(wú)顯著影響。10μmol/L、40μmol/LFB1處理人類(lèi)正常食管上皮細(xì)胞同時(shí)

12、加入10μmol/L維生素A干預(yù)組，維生素A能明顯下調(diào)FB1對(duì)CyclinD1基因mRNA表達(dá)的上調(diào)作用，上調(diào)FB1對(duì)CyclinE、P16、P21基因mRNA表達(dá)的下調(diào)作用;20μmol/LFB1處理人類(lèi)正常食管上皮細(xì)胞同時(shí)加入10μmol/L維生素A干預(yù)組，維生素A能明顯下調(diào)FB1對(duì)CyclinD1基因mRNA表達(dá)的上調(diào)作用，上調(diào)FB1對(duì)CyclinE、P21基因mRNA表達(dá)的下調(diào)作用，但對(duì)FB1改變其他基因mRNA表達(dá)的作用無(wú)顯著

13、影響;其余干預(yù)組對(duì)FB1改變其他基因mRNA表達(dá)的作用無(wú)顯著影響。20μmol/L、40μmol/FB1處理人類(lèi)正常食管上皮細(xì)胞同時(shí)加入10μmol/L維生素A干預(yù)組，維生素A能明顯下調(diào)FB1對(duì)CyclinD1基因蛋白表達(dá)的上調(diào)作用，上調(diào)FB1對(duì)CyclinE、P21、P27、PKC基因蛋白表達(dá)的下調(diào)作用;10μmol/LFB1處理人類(lèi)正常食管上皮細(xì)胞同時(shí)加入10μmol/L維生素A干預(yù)組，維生素A均能明顯下調(diào)FB1對(duì)CyclinD1基

14、因蛋白表達(dá)的上調(diào)作用，上調(diào)FB1對(duì)CyclinE、P21、P27基因蛋白表達(dá)的下調(diào)作用，但對(duì)FB1上調(diào)PKC基因蛋白表達(dá)的作用無(wú)顯著影響;其余干預(yù)組對(duì)FB1改變其他基因蛋白表達(dá)的作用無(wú)顯著影響。
　　結(jié)論：FB1能夠促進(jìn)人類(lèi)正常食管上皮細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期，導(dǎo)致S期和G2/M期阻滯。其分子生物學(xué)機(jī)制可能通過(guò)促進(jìn)PKC基因蛋白表達(dá)，在mRNA表達(dá)水平上調(diào)CyclinD1基因，下調(diào)P16、P21、P2

15、7基因，在蛋白表達(dá)水平上上調(diào)CyclinD1基因，下調(diào)P21、P27基因。人群病例對(duì)照研究提示FB1可能通過(guò)改變細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，提高食管癌的發(fā)病危險(xiǎn)，同時(shí)FB1暴露與維生素A不足可能在食管癌的發(fā)生過(guò)程中有協(xié)同作用。食管癌患者癌組織P16、P21、P27基因mRNA表達(dá)明顯低于癌旁組織，CyclinD1、PKC基因mRNA表達(dá)與癌旁組織間比較在數(shù)值上有上調(diào)趨勢(shì)，癌組織CyclinD1和PKC的蛋白表達(dá)上調(diào)，而P21、P27基因蛋白