MCMV感染同種異型皮膚移植小鼠急性間質(zhì)性肺炎模型的建立.pdf

1、目的:建立小鼠巨細(xì)胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV)經(jīng)鼻腔感染同種異型皮膚移植BALB/c小鼠急性間質(zhì)性肺炎模型。
　　方法:(一)建立同種異型皮膚移植BALB/c小鼠模型:采用21只供體C57BL/6與84只受體BALB/c雌鼠,背部皮膚移植后,每只小鼠腹腔注射環(huán)孢素(CsA,15mg/kg),連續(xù)給藥14d,在此期間,每天觀察移植小鼠的生存狀況和皮膚存活狀況;在第14d,通過(guò)ELISA法檢測(cè)小鼠血

2、漿中IFN-γ水平。
　　(二)建立MCMV感染受體小鼠急性間質(zhì)性肺炎模型:(1)實(shí)驗(yàn)分組:將移植14d后的受體小鼠隨機(jī)分為5組(n=16),實(shí)驗(yàn)組為4組分別以1×102 PFU/ml/只(A組),1×103 PFU/ml/只(B組),1×104 PFU/ml/只(C組),1×105PFU/ml/只(D組)不同劑量MCMV懸液鼻腔接種受體BALB/c小鼠,另一組為正常對(duì)照組(E組),每只小鼠鼻腔接種原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mous

3、e embryonic fibroblasts,MEF)懸液50μl/只。(2)檢測(cè)方法:在感染病毒后逐日觀察小鼠的一般變化;并在感染后第5,9,14和21d,無(wú)菌取小鼠肺組織分別做 HE染色,MCMV病毒分離,透射電鏡,PCR,RT-PCR檢測(cè)MCMV即刻早期基因(IE)和晚期基因(M55)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和Real timePCR檢測(cè)MCMV IE DNA拷貝數(shù),以及原位雜交和免疫組織化學(xué)試驗(yàn)等方法。
　　結(jié)果:(一)同種異型皮膚移

4、植受體小鼠在移植術(shù)后觀察BALB/c小鼠在連續(xù)14d給藥期間,部分小鼠活動(dòng)能力下降、體重減輕,部分小鼠移植皮片有毛發(fā)生長(zhǎng),大部分移植小鼠移植處可見(jiàn)皮下血管化形成,皮片平均存活時(shí)間(MST)為13.5±0.3d。在移植14d后,通過(guò)ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)受體小鼠比正常小鼠血漿中IFN-γ水平明顯降低(p<0.05),表明移植受體小鼠處于免疫抑制狀態(tài),同種異型皮膚移植成功。
　　(二)(1)觀察感染后各組小鼠的生存狀態(tài),D組小鼠相比其他

5、組有明顯的嗜睡、厭食、體重下降;用統(tǒng)計(jì)軟件分析各組小鼠體重指標(biāo),顯示D組與其他組之間存在顯著差異(P<0.01)。(2)各感染組肺組織經(jīng)HE染色,觀察各組小鼠肺組織病理變化,發(fā)現(xiàn)C組和D組小鼠肺組織有局灶性的病理?yè)p害,并發(fā)現(xiàn)感染第14和21d后D組肺組織病理改變最明顯表現(xiàn)為:肺泡內(nèi)出血、肺泡壁增寬、肺泡破裂形成肺大皰、肺上皮細(xì)胞腫大,肺間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡腔變小,以及在肺葉邊緣有代償性肺氣腫產(chǎn)生;(3)病毒分離:各組小鼠在感染后第5

6、,9,14,21d均取肺組織勻漿接種MEF細(xì)胞盲傳3代后,C組和D組在第5,9,14d可見(jiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE),陽(yáng)性率分別為37.5％和62.5%,低劑量組未見(jiàn)CPE;(4)在感染后的5,9,14,21d,檢測(cè)各感染組MCMV IE和M55 DNA和RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,結(jié)果為各感染組MCMV IE和M55 DNA均為陽(yáng)性;各感染組MCMV IE mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為陽(yáng)性,在感染后的9,14,21d,M55 mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物陽(yáng)性率分別為43.

7、8%,62.5%,75%,病毒處于活動(dòng)性感染狀態(tài);(5)Real timePCR檢測(cè)各感染組小鼠肺組織中MCMV IE DNA拷貝數(shù)發(fā)現(xiàn)高劑量組(C和D組)在21d內(nèi)病毒拷貝數(shù)有明顯的變化,在第5和9d高于第14和21d,第9d達(dá)到峰值,此時(shí)C組最高拷貝數(shù)為(1.35±0.10×104copies/μg),D組最高拷貝數(shù)為(5.57±0.15×104copies/μg),且D組病毒拷貝數(shù)最高,在感染第14d,C和D組病毒拷貝數(shù)分別為1.

8、81±0.24×102copies/μg和2.05±0.05×103copies/μg,病毒拷貝數(shù)相對(duì)有所降低,低劑量組(A和B組)MCMV IE DNA拷貝數(shù)變化不明顯;(6)經(jīng)透射電鏡檢測(cè)各組小鼠肺組織可見(jiàn)C組和D組上皮細(xì)胞內(nèi)有皰疹樣病毒顆粒;(7)發(fā)現(xiàn)C和D組小鼠肺組織原位雜交和免疫組織化學(xué)檢測(cè)均在肺間質(zhì)上皮細(xì)胞中檢測(cè)病毒特異性核酸和蛋白,而在正常對(duì)照組小鼠肺組織中均為陰性。
　　結(jié)論:(一)依據(jù)小鼠移植皮膚的存活時(shí)間和免疫

9、抑制狀態(tài)確定建立了同種異型皮膚移植小鼠模型。
　　(二)在感染MCMV后的不同時(shí)間,對(duì)各組受體小鼠肺組織的HE染色、透射電鏡、原位雜交和免疫組化檢測(cè),可見(jiàn)病毒存在肺組織上皮細(xì)胞內(nèi),高劑量組肺組織病理檢測(cè)可見(jiàn)典型的間質(zhì)性肺炎樣病變,并發(fā)現(xiàn)感染后14和21d肺組織損傷較為嚴(yán)重;通過(guò)病毒分離,PCR,RT-PCR和Real timePCR等檢測(cè),可見(jiàn)病毒IE和M55 DNA,mRNA存在,即病毒處于活動(dòng)性感染狀態(tài),感染后高劑量組病毒拷貝