表沒食子兒茶素沒食子酸酯對(duì)3T3-L1細(xì)胞增殖、分化及血管生成的影響.pdf

1、背景：
　　肥胖是一種復(fù)雜的多因素的慢性疾病，是糖尿病、高血壓、腫瘤和心血管疾病的危險(xiǎn)因素，肥胖及其相關(guān)慢性病的防治是營養(yǎng)與健康研究與實(shí)踐工作的重點(diǎn)。肥胖的發(fā)展是以脂肪細(xì)胞數(shù)量增加和細(xì)胞體積肥大所導(dǎo)致的脂肪積聚為特征。目前認(rèn)為，脂肪組織的增生需要建立新生血管提供足夠的氧氣和營養(yǎng)，阻斷脂肪組織的血管生成可能是一個(gè)抑制脂肪生成的新途徑。脂肪組織是人體內(nèi)最大的內(nèi)分泌組織之一，可產(chǎn)生多種脂肪因子調(diào)節(jié)其自身及機(jī)體代謝，其中，它所分泌的血管內(nèi)

2、皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）被認(rèn)為是促進(jìn)脂肪組織血管新生最重要的調(diào)節(jié)因子。最新研究證據(jù)表明，調(diào)節(jié)血管生成的藥物能通過調(diào)節(jié)脂肪組織脈管系統(tǒng)的生長和重構(gòu)來影響脂肪的擴(kuò)張和代謝。因此，針對(duì)脂肪組織的血管生成調(diào)節(jié)劑為肥胖癥的治療提供了一種新的治療選擇。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（(-)-Epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是綠茶中最豐富且最具有活性的成分，

3、已有研究證實(shí)其對(duì)肥胖有防治作用。幾項(xiàng)腫瘤新生血管抑制實(shí)驗(yàn)表明，EGCG具有抑制腫瘤新生血管形成的作用。那么，EGCG是否具有抑制脂肪組織血管生成的潛力？目前尚無研究報(bào)道。我們假設(shè)EGCG可以通過抑制脂肪組織血管新生途徑調(diào)節(jié)脂肪組織生成及其功能。本課題在培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞水平擬對(duì)上述假設(shè)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　目的：
　　1．通過觀察EGCG對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響，了解EGCG對(duì)脂肪組織生成的影響；
　　2．通過觀

4、察EGCG在3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖和分化過程對(duì)VEGF表達(dá)的影響，以及脂肪細(xì)胞分泌的VEGF對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC）增殖及小管形成的影響，了解EGCG對(duì)血管生成的作用；
　　3．通過觀察EGCG對(duì)脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子PPARγ、C/EBPα對(duì)VEGF表達(dá)的作用，初步探索EGCG調(diào)控脂肪組織血管生成的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1．采用x

5、CELLigence實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)觀察不同濃度的EGCG對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞增殖的影響；
　　2．采用油紅O染色法檢測(cè)不同濃度的EGCG對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響；
　　3．采用ELISA法檢測(cè)不同濃度的EGCG處理的3T3-L1前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF的含量；采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)不同濃度的EGCG對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)

6、不同濃度的EGCG對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響；
　　4．采用蛋白免疫印跡反應(yīng)（Western Blotting）法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)不同濃度的EGCG對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞PPARγ、C/EBPα的蛋白表達(dá)水平和mRNA水平的影響；
　　5．建立3T3-L1細(xì)胞和HUVEC的共培養(yǎng)體系，采用xCELLigence實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)觀察3T3-L1前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞對(duì)HUVEC增殖的影響；收

7、集采用EGCG和未采用EGCG處理的3T3-L1脂肪細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用于培養(yǎng)接種于Matrigel膠上的HUVEC，觀察其對(duì)HUVEC小管生成的影響。
　　結(jié)果：
　　1．與對(duì)照組相比，0.5μg/ml~50μg/ml EGCG刺激均對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖顯著的抑制作用（P<0.05），且該作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系。
　　2．雖然≤10μg/ml的EGCG刺激對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化沒有明顯的影響

8、，但是高達(dá)25μg/ml的EGCG刺激能抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化（P<0.05）。
　　3．5μg/ml~50μg/ml EGCG刺激能抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的細(xì)胞上清液中VEGF分泌。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VEGF在3T3-L1脂肪細(xì)胞中的表達(dá)比與3T3-L1前脂肪細(xì)胞更多。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，EGCG能顯著降低3T3-L1前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中VEGF的表達(dá)。
　　4．Western Blo

9、tting和實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，EGCG能顯著降低3T3-L1脂肪細(xì)胞PPARγ、C/EBPα的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)。
　　5．3T3-L1細(xì)胞能刺激HUVEC的增殖，25μg/ml的EGCG處理的3T3-L1脂肪細(xì)胞的細(xì)胞上清液能夠抑制HUVEC小管生成。
　　結(jié)論：
　　首先，EGCG具有抑制前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的增殖，減少前脂肪細(xì)胞的分化，并降低脂質(zhì)在脂肪細(xì)胞中積累的能力。其次，在細(xì)胞水平，我們發(fā)現(xiàn)EG