8-OHdG和NADPH氧化酶p47phox G338A基因多態(tài)性與2型糖尿病大血管病變的相關(guān)性研究.pdf

1、目的:2型糖尿病(type2 diabetes mellitus，T2DM)是由遺傳和環(huán)境因素共同作用所致的代謝性疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。流行病學(xué)調(diào)查顯示，遺傳基因在糖尿病及其慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用，對糖尿病易感基因的研究是近年來糖尿病遺傳機(jī)制研究的重點和熱點。T2DM慢性并發(fā)癥中大血管病變病情重、死亡率高，其病理改變的基礎(chǔ)是動脈粥樣硬化（arteriosclerosis，AS）。目前研究表明，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH

2、)氧化酶來源的活性氧(reactive oxygen species，ROS)與糖尿病和AS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而p47phox是NADPH氧化酶系統(tǒng)的主要成份，在中性粒細(xì)胞和血管系統(tǒng)ROS的產(chǎn)生過程中發(fā)揮了重要作用。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）作為研究疾病基因多態(tài)性的新工具，廣泛應(yīng)用于定位多基因疾病的主要致病基因及進(jìn)行發(fā)病機(jī)理的研究。目前對p47phox基因SNP與T2DM關(guān)系

3、的研究較少。ROS在體內(nèi)過度蓄積，氧化應(yīng)激水平超出體內(nèi)抗氧化能力時會造成DNA的氧化損傷。8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG)可以反映整個機(jī)體平均的氧化損傷率及體內(nèi)DNA氧化損傷與機(jī)體的正常修復(fù)作用，其在人體的含量穩(wěn)定且靈敏度高，是評價氧化應(yīng)激強(qiáng)度的最佳指標(biāo)。本研究旨在通過研究p47phox基因SNP與T2DM及其大血管病變的關(guān)系，從分子水平探討其發(fā)病機(jī)制，為預(yù)防和治療提供理論依據(jù);同時

4、觀察T2DM患者血清8-OHdG水平，明確在T2DM及其大血管病變發(fā)生中NADPH氧化酶起到的作用。
　　方法:按1999年WHO提出的T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇沒有血緣關(guān)系的T2DM患者共300例，按是否合并大血管病變分成單純T2DM組156例，男90例，女66例，最大年齡77歲，最小年齡31歲，平均年齡51.6±10.0歲，平均病程4.2±1.3年;T2DM大血管病變組144例，男84例，女60例，最大年齡76歲，最小年齡28歲，

5、平均年齡55.0±11.3歲，平均病程10.6±2.3年。正常對照組:為同期我院醫(yī)務(wù)人員及常規(guī)體檢人群中健康個體140例，男85例，女55例，最大年齡76歲，最小年齡36歲，平均年齡53.0±9.1歲，無心、腦、肝、腎臟病史。受試者禁食12小時，空腹抽取兩管4ml靜脈血，一管用乙二胺乙酸抗凝，用于提取基因組DNA，另一管分離血清，用于生化指標(biāo)和8-OHdG的檢測，靜脈血和血清均于-20℃冰箱保存。
　　1臨床指標(biāo)的測定
　　

6、1.1測定身高、體重、腰圍、臀圍、收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)和踝動脈壓，計算體重指數(shù)(bodymass index，BMI)=體重/身高2、腰/臀(waist-to-hip ratio，WHR)=腰圍/臀圍和踝肱指數(shù)（Ankle brachial pressure index，ABI）=踝動脈收縮壓/肱動脈收縮壓。
　　1.2

7、應(yīng)用全自動生化分析儀測定空腹血糖(fasting blood-glucose，F(xiàn)BG)、甘油三酯(triglycerides，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）及高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）。
　　1.3用免疫比濁法測定糖化

8、血紅蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)。
　　2酶聯(lián)免疫吸附法測定8-OHdG的水平。
　　3 NADPH氧化酶p47phox基因G338A多態(tài)性的檢測
　　3.1人基因組DNA樣品的制備:用血液基因組DNA小量提取試劑盒（由上海捷瑞生物工程有限公司提供）提取乙二胺乙酸抗凝血外周血基因組DNA，然后分光光度儀測定DNA溶液濃度和純度。
　　3.2聚合酶鏈反應(yīng)(PCR):擴(kuò)增模板為外周血白細(xì)胞基因組D

9、NA，上、下游引物序列分別是:5'-TCCCAAGTGGTTTGACGG-3'、5'-CCTCCTCTTTCTGGCTGTG-3'，25μl反應(yīng)體系含基因組DNA2μl，上下游引物各1μl，PCR Premix12.5μl，滅菌蒸餾水8.5μl。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3分鐘，94℃變性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸40秒，共35個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸3分鐘，反應(yīng)管4℃冷卻10分鐘。然后將PCR產(chǎn)物純化，將純化后的PCR產(chǎn)物在

10、測序儀上測序。
　　4統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用SPSS19.0軟件處理所有數(shù)據(jù)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。對計量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示;各組基因頻率的群體代表性用Hardy-Weinberg平衡法檢驗;計量資料的組間比較用方差分析;計數(shù)資料的組間比較用x2檢驗;8-OHdG濃度與其他因素的相關(guān)性分析采用Spearman或Pearson相關(guān)分析;用logistic逐步回歸分析T2DM大血管病變發(fā)生的

11、危險因素，以P＜0.05定義為選入標(biāo)準(zhǔn)，P＞0.10為剔除標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果:
　　1 T2DM組與正常對照組的年齡、性別、BMI的構(gòu)成比無顯著性差別，具有可比性;單純T2DM和T2DM大血管病變組的吸煙史、WHR、SBP、DBP、TC、TG、LDL-C及FBG水平顯著高于正常對照組（t分別為-1.563、-1.793、-2.474、-2.296、-1.952、-1.504、-2.261、-7.191和-1.784、-2.41

12、0、-2.774、-2.576、-1.569、-1.752、-2.710、-8.675，均P＜0.05),HDL-C水平低于正常對照組（t分別為2.183和4.224，均P＜0.05）;T2DM大血管病變組的糖尿病病程、吸煙史、WHR、SBP、DBP、TG、LDL-C、FBG及HbA1c水平顯著高于單純T2DM(t分別為-2.681、-2.716、-3.328、-3.002、-2.863、-3.619、-2.299、-1.979和-2.

13、037，均P＜0.05)，ABI、HDL-C水平低于單純T2DM組(t分別為1.913和1.863，均P＜0.05)。單純T2DM組8-OHdG水平（6.41±2.04ng/ml）較正常對照組（4.16±2.11 ng/ml）明顯升高（t=-4.662，P＜0.05），大血管病變組（7.88±2.80ng/ml）明顯高于單純T2DM組和正常對照組（t分別為-3.215和-6.354，均P＜0.05）。
　　28-OHdG與糖尿病病

14、程、吸煙史、TC、FBG及HbA1c呈顯著正相關(guān)（r分別為0.324、0.337、0.172、0.213和0.328，均P＜0.05），與ABI和HDL-C呈顯著負(fù)相關(guān)（r分別為-0.383和-0.173，均P＜0.05），與年齡、BMI、WHR、TG和LDL-C無顯著相關(guān)性。
　　3正常對照組、單純T2DM組、T2DM大血管病變組GA+AA基因型頻率分別為7.14％、21.15％和29.17％，A等位基因頻率分別為3.57％、1

15、1.54％和15.97％。比較各組GA+AA基因型頻率和等位基因A頻率，單純T2DM組和T2DM大血管病變組均高于正常對照組（x2分別為11.665、23.020和13.070、24.566，均P＜0.05），單純T2DM組和T2DM大血管病變組間無顯著性差異（x2分別為2.564和2.495，P分別為0.109和0.114）。
　　4與GG型相比，GA+AA型的高血壓病史、BMI、SBP、DBP、FBG、HbA1c及8-OHdG

16、升高（t分別為-2.163、-2.090、-2.624、-3.011、-2.870、-1.989和-2.037，均P＜0.05），ABI降低（t=2.184，P＜0.05）。兩組間年齡、性別、病程、冠心病病史、腦卒中病史、WHR、TC、TG、LDL-C和HDL-C無顯著差別(P＞0.05)。GA+AA型大血管病變發(fā)生率為49.4％，高于GG型大血管病變發(fā)生率的28.7％(X2=13.32，P＜0.05)。
　　5在T2DM患者中，

17、有無大血管病變作為因變量進(jìn)行逐步回歸分析，結(jié)果顯示糖尿病病程、SBP、ABI、LDL-C及8-OHdG是大血管病變的獨立危險因素(β分別為0.227、0.484、-1.162、1.756和0.224，均P＜0.05)。將T2DM大血管病變組患者根據(jù)是否合并高血壓進(jìn)行分組后再比較，發(fā)現(xiàn)T2DM大血管病變合并高血壓患者中，糖尿病病程、ABI、LDL-C、8-OHdG和等位基因A是其獨立危險因素(β分別為0.534、-0.765、1.467、

18、0.526和0.509，均P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1 T2DM患者血清8-OHdG水平升高，提示其體內(nèi)存在氧化應(yīng)激，并且T2DM大血管病變者較單純T2DM患者更顯著。
　　2 T2DM患者血清8-OHdG水平與NADPH氧化酶G338A基因多態(tài)性相關(guān)，A等位基因攜帶者血清8-OHdG水平較高，后者是T2DM大血管病變的危險因素。
　　3 p47phox亞基G338A基因多態(tài)性可能與T2DM大血管病變的易