去神經支配對側支血管生長的作用及其機制的研究.pdf

1、目的:探討去神經支配對大鼠/兔后肢股動脈結扎誘導的側支血管生長的影響及其可能的機制，豐富和完善側支血管生長機制的理論，為缺血性疾病的治療尋找促側支血管生長新的途徑。
　　 方法:動物模型:成年SD健康大鼠52只和8只新西蘭大白兔，切斷右側坐骨神經，存活1W后重新對動物進行麻醉，在腹股溝的深面暴露股動脈三角區(qū)域，將股動脈分離，在股深動脈的稍下方采用雙結扎法結扎股動脈，同時在右側股深動脈發(fā)出處用10％的苯酚溶液涂擦將結扎股動脈近側端

2、的分支神經損毀，然后再切斷右側股神經，左側僅行單純股動脈結扎，建立大鼠/兔后肢股動脈結扎和后肢股動脈結扎結合坐骨神經和股神經切除誘導側支血管生長模型;單純去神經組除不結扎股動脈外，其余步驟同上;
　　 實驗方法及檢測指標:第一部分:研究去神經支配對大鼠后肢缺血誘導側支血管生長的影響。上述32只大鼠動物模型分別存活1W和8W（分別為側支血管生長活躍期和成熟期），采用血管造影、組織學以及共聚焦免疫熒光術，觀察保留和去神經支配對大鼠后

3、肢側支血管生長的影響;
　　 第二部分:研究去神經支配對大鼠/兔后肢股動脈結扎誘導的側支血管生長激活的影響。利用上述模型中的12只實驗大鼠和8只實驗新西蘭大白兔，通過共聚焦免疫熒光術，觀察去神經支配對大鼠/兔后肢側支血管生長過程中與炎癥密切相關的細胞因子如ICAM（細胞粘附分子）、VCAM（血管細胞粘附分子）、MCP-1（單核細胞趨化因子）和CD11b（單核/巨噬細胞標志物）以及Ki67（細胞增殖標志物）、Vimentin（外膜

4、成纖維細胞和平滑肌合成表型標志物）、MMP-2（基質金屬蛋白酶-2）和eNOS（一氧化氮合酶）等表達的影響;
　　 第三部分:研究神經對側支血管生長的可能作用機制，主要從在體和離體兩方面進行研究:①動物實驗:觀察去神經支配后神經分泌素(Secretoneurin，SN)在側支血管生長中的表達變化;同時利用上述大鼠動物模型中的8只以10μg/d的SN劑量在大鼠股動脈結扎側后肢股薄肌處進行局部注射，存活1W，通過共聚焦免疫熒光術，觀

5、察SN對側支血管生長過程中細胞增殖和單核/巨噬細胞浸潤的影響。②細胞培養(yǎng):鑒于血管平滑肌細胞是側支動脈血管的主要細胞以及在側支血管靠近外膜處的平滑肌細胞表達VCAM和MCP-1等，故采用大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞體外培養(yǎng)，取5-6代細胞用于實驗研究，平滑肌細胞經特異性的抗平滑肌細胞肌動蛋白(α-SM actin)抗體鑒定，分為正常對照組、1ng/ml SN組、10ng/ml SN組、100ng/ml SN實驗組，SN作用24h后，運用M

6、TT比色法檢測不同濃度的SN對血管平滑肌細胞增殖活性的影響，并采用免疫印跡和免疫細胞化學法檢測SN對血管平滑肌細胞表達VCAM-1（血管細胞粘附分子）和MCP-1（單核細胞趨化因子）的影響。
　　 結果:第一部分:單純股動脈結扎側，血管造影可見明顯密集呈網狀分布的側支血管，組織學和共聚焦免疫熒光術可見血管壁各層結構發(fā)生重塑，生長的側支血管管腔增大，管壁較薄，呈外向性生長方式的特征，且骨骼肌纖維形態(tài)完好，排列規(guī)則;股動脈結扎加去神

7、經側，側支血管的數(shù)目雖然比正常增多，但明顯少于單純股動脈結扎側;側支血管管腔狹窄，管壁變厚，骨骼肌肌纖維出現(xiàn)降解，體積減少，肌間隙增寬。
　　 第二部分:去除神經支配后，側支血管粘附分子ICAM和VCAM在血管內皮的表達下降不明顯，但外膜和靠近外膜的中膜處VCAM和MCP-1的表達則明顯降低，與此相對應單核/巨噬細胞（CD11b陽性細胞）的數(shù)目在血管壁明顯減少;另外，和單純股動脈結扎相比，在側支血管生長活躍期外膜成纖維細胞的數(shù)目

8、較少，MMP-2的表達較低，而在側支血管成熟期成纖維細胞數(shù)目增加，但中膜Vimentin及eNOS的表達一直呈高水平。
　　 第三部分:①單純股動脈結扎側，SN免疫陽性神經纖維主要表達在側支血管外膜，去除神經后SN的表達明顯減少至消失;股動脈結扎+局部注射SN后，側支血管細胞增殖的數(shù)目和單核/巨噬細胞的表達均明顯增加。②用抗平滑肌細胞肌動蛋白的抗體對培養(yǎng)的血管平滑肌細胞的純度進行鑒定，98％的細胞為α-SM actin免疫陽性細

9、胞。MTT比色法發(fā)現(xiàn)不同濃度的SN作用后，血管平滑肌細胞的增殖活性均明顯增強;免疫細胞化學和免疫印跡均顯示SN能刺激血管平滑肌細胞VCAM和MCP-1的表達明顯上調。
　　 結論:①在大鼠/兔后肢股動脈結扎誘導的側支血管生長模型，去除神經支配后，側支血管的數(shù)目減少，血管管壁增厚，管腔變窄呈內向性的生長方式，導致血流減少供血不足，造成骨骼肌的缺血和損害;②去神經支配導致血管壁特別是外膜SN和細胞因子(VCAM和MCP-1)的表達下