基于數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)的表觀遺傳分子標(biāo)志在肺癌早期診斷中的應(yīng)用.pdf

1、目前肺癌已成為人類癌癥死亡的主要原因，是當(dāng)今公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重大難題。因此，降低肺癌患者死亡率的關(guān)鍵在于早期診斷。肺癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多階段、多基因表達(dá)改變的復(fù)雜生物學(xué)過程，其發(fā)生的早期生物效應(yīng)包括DNA甲基化和端粒損傷在內(nèi)的表觀遺傳學(xué)和遺傳學(xué)改變。
　　DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)修飾的主要形式，其主要通過對(duì)CpG序列的胞嘧啶進(jìn)行甲基化修飾來調(diào)控基因的表達(dá)，DNA序列本身并不改變。抑癌基因的啟動(dòng)子CpG島甲基化使該基因在轉(zhuǎn)錄水平上

2、失活，導(dǎo)致相關(guān)蛋白表達(dá)缺少，間接促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生。
　　DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA-methyltransferase，DNMTs)催化下，以S腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到DNACpG二核苷酸的胞嘧啶第5碳原子上的反應(yīng)。這種表達(dá)上調(diào)的發(fā)生通常先于甲基化模式異常，所以被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)具有特征的早期分子改變，其可以通過促進(jìn)DNA高甲基化參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。
　　與異常DNA甲基化類似，組蛋白修飾在基

3、因的表達(dá)調(diào)節(jié)中同樣扮演重要角色。在組蛋白的修飾中，研究最多的是乙?；＝M蛋白乙?；c去乙酰化，分別是由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histoneacetyltransferases，HAT)和去乙?；D(zhuǎn)移酶(histonedeacetylase，HDAC)催化的。研究證明，HDAC能阻斷抑制肺癌發(fā)生的關(guān)鍵基因通路，而且HDAC激活可能促進(jìn)腫瘤形成。
　　由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程極其復(fù)雜，這些早期的分子標(biāo)志改變對(duì)肺癌診斷的特異性并不高。目前人們

4、多應(yīng)用腫瘤標(biāo)志聯(lián)合檢測，以提高靈敏度和特異度，但存在多參數(shù)及腫瘤標(biāo)志之間的相互作用等問題，而解決這些問題的傳統(tǒng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法一般都要求數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，但實(shí)際資料很少能滿足這樣的條件，故無法深層次利用這些數(shù)據(jù)。隨著數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)的發(fā)展，其在解決大量的變量帶來的多參數(shù)問題上具有獨(dú)特的優(yōu)勢，因此，利用早期分子生物標(biāo)志及臨床參數(shù)建立合適的智能型分類模型，將提高肺癌的早期診斷準(zhǔn)確率。
　　既往研究對(duì)象大部分為肺癌患者手術(shù)取得的腫瘤組織，而對(duì)于外

5、周血甲基化的研究甚少。該研究擬檢測研究對(duì)象血清中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶及組蛋白去乙酰化轉(zhuǎn)移酶1蛋白表達(dá)水平與外周血DNA抑癌基因甲基化水平及端粒相對(duì)長度，探討DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶1和DNA甲基化及端粒長度是否為肺癌早期分子事件，以及這些異常的分子標(biāo)志作為肺癌早期診斷可能性及聯(lián)合檢測對(duì)肺癌診斷的價(jià)值和它們之間的相關(guān)關(guān)系，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，構(gòu)建智能型的預(yù)測模型，探討有助于提高早期肺癌診斷的正確率及聯(lián)合檢測對(duì)肺癌輔助診斷

6、的意義，為高危人群的篩查和臨床肺癌早期診斷提供依據(jù)。
　　目的：
　　(1)在肺癌組、肺良性疾病組及正常組血清中檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶及組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶1蛋白表達(dá)水平;檢測外周血DNA中FHIT、RASSF1A、MGMT基因啟動(dòng)子甲基化及端粒相對(duì)長度。
　　(2)應(yīng)用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)與傳統(tǒng)的Logistic回歸模型相比較，對(duì)分子指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化組合，構(gòu)建肺癌早期分子診斷模型。
　　材料與方法：
　　1.研究對(duì)象的

7、選擇:136例原發(fā)性肺癌患者的外周血標(biāo)本于2012年9月至2013年6月取自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科及呼吸內(nèi)科住院患者;140例肺良性疾病患者外周血取自同期鄭州市第六人民醫(yī)院肺科住院患者;145例正常對(duì)照組外周血取自同期鄭州市第六人民醫(yī)院體檢科體檢的正常人群。經(jīng)醫(yī)院臨床倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及研究對(duì)象知情同意后，由專業(yè)的調(diào)查員和醫(yī)生收集研究對(duì)象的流行病學(xué)資料并采集血液做相應(yīng)的處理。
　　2.DNA甲基轉(zhuǎn)移酶及組蛋白去乙酰化轉(zhuǎn)移酶檢測:采

8、用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法檢測血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b及HDAC1的蛋白表達(dá)水平。
　　3.實(shí)時(shí)熒光定量甲基化特異性PCR:用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析外周血DNAFHIT、RASSF1A和MGMT基因啟動(dòng)子甲基化及端粒相對(duì)長度。
　　4.統(tǒng)計(jì)分析方法:采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件。根據(jù)數(shù)據(jù)分布類型選擇表達(dá)方法及組間統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方法。采用x2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)、非條件Logistic回歸等方法，分析血清

9、中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶及組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶1蛋白表達(dá)水平和外周血DNA中FHIT、RASSF1A、MGMT基因甲基化水平及端粒相對(duì)長度，探討DNA甲基轉(zhuǎn)移酶及組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶1與抑癌基因甲基化和端粒相對(duì)長度與早期肺癌的關(guān)系。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。
　　5.建立模型方法:應(yīng)用SPSSClementine12.0軟件進(jìn)行Logistic回歸分析、決策樹、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和支持向量機(jī)數(shù)據(jù)挖掘分析。將DNMT1、DNMT3a、DNMT3b

10、、HDAC1、MGMT、RASSF1A、FHIT和性別、年齡、吸煙史等變量納入模型，將樣本按3∶1的比例隨機(jī)分成訓(xùn)練集和預(yù)測集，用訓(xùn)練好的模型對(duì)預(yù)測集進(jìn)行預(yù)測，并結(jié)合診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)模型的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果:
　　1.肺癌患者血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC1蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組及肺良性疾病組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);肺癌患者血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC

11、1蛋白表達(dá)與肺癌的組織學(xué)類型及臨床分期無關(guān)（P＞0.05）。
　　2.外周血DNAMGMT、RASSF1A和FHIT基因啟動(dòng)子甲基化水平在肺癌組均高于肺良性疾病組及對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;單因素分析MGMT甲基化水平在肺癌組與性別、年齡及組織學(xué)類型有關(guān)(P＜0.05);RASSF1A甲基化水平在肺癌組與年齡及臨床分期有關(guān)(P＜0.05);FHIT基因甲基化水平在肺癌組與年齡及組織學(xué)類型有關(guān)(P＜0.05);分別

12、將3個(gè)基因啟動(dòng)子甲基化水平分為4組及2組后，隨著甲基化水平的增加，肺癌的危險(xiǎn)性增加(Ptrend＜0.05)。
　　3.肺癌組端粒長度明顯短于肺良性組及正常人組(P＜0.001);多元線性回歸分析結(jié)果提示，性別、年齡、吸煙史均與端粒長度相關(guān)（P＜0.001），且隨著年齡的增加也會(huì)使端粒長度縮短（P＜0.001）。
　　4.Logistic回歸對(duì)肺癌診斷的預(yù)測靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和受試者工作特征曲線下

13、面積(AUC)分別為68.0％、88.6％、70.9％、60.7％、95.1％和0.923，對(duì)101例（Ⅰ期+Ⅱ期）早期肺癌的預(yù)測準(zhǔn)確率達(dá)到89.11％;決策樹對(duì)肺癌診斷的預(yù)測靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和AUC分別為77.8％、95.1％、81.2％、75.0％、95.1％和0.946，對(duì)101例（Ⅰ期+Ⅱ期）早期肺癌的預(yù)測準(zhǔn)確率達(dá)到99.01％;神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)肺癌診斷的預(yù)測靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值

14、和AUC分別為59.1％、78.0％、60.5％、46.4％、95.1％和0.877，對(duì)101例（Ⅰ期+Ⅱ期）早期肺癌的預(yù)測準(zhǔn)確率達(dá)到88.12％;支持向量機(jī)對(duì)肺癌診斷的預(yù)測靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和AUC分別為54.5％、87.5％、62.6％、64.3％、85.4％和0.851，對(duì)101例（Ⅰ期+Ⅱ期）早期肺癌的預(yù)測準(zhǔn)確率達(dá)到92.08％;對(duì)101例（Ⅰ期+Ⅱ期）早期肺癌的預(yù)測支持向量機(jī)的AUC僅次于決策樹，明

15、顯高于Logistic回歸和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。
　　結(jié)論:
　　1.血清中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶及組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶1高表達(dá)可能與肺癌有關(guān)，可能是肺癌發(fā)病的早期效應(yīng)生物學(xué)標(biāo)志;但無組織學(xué)特異性并與肺癌病情進(jìn)展、預(yù)后無關(guān)。
　　2.外周血DNAMGMT、RASSF1A和FHIT基因啟動(dòng)子異常甲基化可能與肺癌有關(guān)，可抑制基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤發(fā)生;外周血DNA端粒相對(duì)長度縮短可增加患肺癌的危險(xiǎn)性。
　　3.成功構(gòu)建基于DNA甲基轉(zhuǎn)移