重組激活基因1在杏仁核中的表達(dá)及其功能研究.pdf

1、背景:
　　學(xué)習(xí)和記憶是腦的高級(jí)功能。深入研究學(xué)習(xí)和記憶的機(jī)理，對(duì)于開(kāi)發(fā)腦的功能，治療與學(xué)習(xí)記憶障礙有關(guān)的疾病等具有重要的意義。杏仁核是邊緣系統(tǒng)的重要結(jié)構(gòu)之一，與學(xué)習(xí)記憶、情緒、情感密切相關(guān)，而且參與精神分裂癥、抑郁、癲癇和創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過(guò)程。杏仁核是條件性恐懼記憶形成和儲(chǔ)存的部位，條件性恐懼記憶是由條件刺激和非條件刺激配對(duì)訓(xùn)練而形成的。
　　重組激活基因-1(recombination activa

2、ting gene-1，RAG1)最早在免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，并且與免疫細(xì)胞特異性的記憶活動(dòng)密切相關(guān)。它編碼的產(chǎn)物與其他相關(guān)蛋白協(xié)同作用，能夠引起V(D)J重排，使得免疫球蛋白和T細(xì)胞受體產(chǎn)生高度多樣性。既往國(guó)外報(bào)道了RAG1基因敲除后可以導(dǎo)致動(dòng)物的免疫記憶功能缺失，引起重度聯(lián)合免疫缺陷疾病。后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有RAG1的轉(zhuǎn)錄，并且表達(dá)的部位主要集中于海馬、邊緣系統(tǒng)等與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的腦區(qū)，然而RAG1是否與學(xué)習(xí)和記憶功能有關(guān)目前尚

3、未明確。
　　大腦和免疫系統(tǒng)都具有編碼記憶的能力，研究資料也表明腦內(nèi)存在著與免疫系統(tǒng)中相類(lèi)似的基因重組。為了明確腦內(nèi)RAG1基因的缺失是否會(huì)影響學(xué)習(xí)記憶功能，通過(guò)對(duì)RAG1敲除小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，RAG1缺失會(huì)引起小鼠神經(jīng)行為的改變。然而，用基因敲除技術(shù)來(lái)研究RAG1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的功能存在著不足之處，因?yàn)閯?dòng)物從胚胎期就開(kāi)始缺失RAG1基因會(huì)造成免疫缺陷，對(duì)其發(fā)育過(guò)程會(huì)產(chǎn)生干擾，從而對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果造成影響。
　　因此本工作

4、采用RNA干擾技術(shù)，避開(kāi)基因敲除技術(shù)的弊端，對(duì)杏仁核區(qū)RAG1的表達(dá)進(jìn)行了基因沉默，比較研究RAG1基因沉默前后大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的變化。
　　第一部分、條件性恐懼訓(xùn)練對(duì)大鼠杏仁核內(nèi)RAG1表達(dá)的影響
　　目的:
　　檢測(cè)條件恐懼訓(xùn)練后大鼠杏仁核區(qū)RAG1的表達(dá)變化。
　　方法與結(jié)果:
　　大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和條件性恐懼實(shí)驗(yàn)組，建立條件恐懼記憶模型，并以呆立時(shí)間(freezing time)評(píng)價(jià)大鼠對(duì)條件恐

5、懼事件的記憶。條件恐懼刺激后30min、1h，應(yīng)用熒光定量PCR對(duì)大鼠杏仁核區(qū)RAG1的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組大鼠在被重新放入電擊箱后，5min內(nèi)的呆立時(shí)間明顯長(zhǎng)于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組杏仁核內(nèi)RAG1的表達(dá)量明顯增加。
　　結(jié)論:
　　條件性恐懼訓(xùn)練會(huì)引起大鼠杏仁核區(qū)RAG1表達(dá)水平增高。
　　第二部分、大鼠RAG1基因shRNA慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定
　　目的:

6、
　　構(gòu)建有效的慢病毒載體，并觀察其對(duì)RAG1表達(dá)的抑制效應(yīng)。
　　方法與結(jié)果:
　　設(shè)計(jì)針對(duì)RAG1基因的最優(yōu)shRNA序列及1對(duì)無(wú)關(guān)序列，經(jīng)單鏈片段的合成和退火后，分別克隆至pMagic4.1載體的酶切位點(diǎn)處，經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定正確后，將重組質(zhì)粒與包膜質(zhì)粒pMD2G、包裝質(zhì)粒pMDlg/pRRE及REV表達(dá)質(zhì)粒pRSV-Rev共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝成慢病毒。Real-time PCR方法測(cè)定病毒滴度，感染體外培養(yǎng)的

7、大鼠神經(jīng)元后，通過(guò)免疫印跡和Real-time PCR檢測(cè)RAG1的表達(dá)水平。測(cè)定LV-shRNA病毒的滴度為2.08×108TU/ml，對(duì)照病毒(LV-Negative)的滴度為1.79×109TU/ml。與未感染慢病毒組相比較，慢病毒感染神經(jīng)元后，RAG1的表達(dá)水平受到明顯的抑制。
　　結(jié)論:
　　根據(jù)RAG1基因序列利用siRNA target finder軟件設(shè)計(jì)出特異性的shRNA序列。成功構(gòu)建了慢病毒載體，該載體

8、能有效感染大鼠原代神經(jīng)元并抑制RAG1的表達(dá)。
　　第三部分、RNA干擾下調(diào)杏仁核RAG1表達(dá)對(duì)大鼠恐懼記憶的影響
　　目的:
　　觀察RAG1被抑制后是否會(huì)影響到恐懼記憶能力，以及隨后觀察杏仁核神經(jīng)元是否有相應(yīng)的形態(tài)學(xué)改變。
　　方法與結(jié)果:
　　SD大鼠隨機(jī)分為三組:分別為正常對(duì)照組，注射干擾病毒組(LV-shRNA)，注射對(duì)照病毒組(LV-Negative)。通過(guò)腦立體定位儀將慢病毒載體注射到大鼠雙側(cè)

9、杏仁核。注射病毒一周后利用RT-PCR檢測(cè)慢病毒干擾RAG1mRNA表達(dá)的效果，并切片觀察注射區(qū)GFP表達(dá)情況。慢病毒注射入杏仁核后，RT-PCR結(jié)果顯示RAG1mRNA水平明顯受到抑制。注射慢病毒一周后，不同批次大鼠分別進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)為逃避潛伏期和穿臺(tái)次數(shù)，結(jié)果顯示注射干擾病毒組與對(duì)照組以及注射對(duì)照病毒組相比沒(méi)有顯著性差異。利用單次被動(dòng)回避反應(yīng)測(cè)定大鼠的記憶能力，大鼠停留在明室的時(shí)間即反應(yīng)潛時(shí)，越長(zhǎng)代表

10、大鼠記憶能力越佳。結(jié)果顯示，在訓(xùn)練階段三組動(dòng)物的反應(yīng)潛時(shí)沒(méi)有顯著性差異，在測(cè)試階段，LV-shRNA組的反應(yīng)潛時(shí)與對(duì)照組、LV-Negative組相比明顯減少。條件性恐懼結(jié)果顯示，LV-shRNA組的呆立時(shí)間與對(duì)照組、LV-Negative組相比明顯減少。各組大鼠在條件性恐懼觀察結(jié)束后立即處死，取杏仁核組織制作電鏡包埋和切片，電鏡觀察結(jié)果顯示LV-shRNA組杏仁核區(qū)單位面積突觸數(shù)目明顯少于正常組大鼠。
　　結(jié)論:
　　慢病