土槿乙酸對(duì)小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:本文研究天然提取的中藥單體土槿乙酸對(duì)小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎的治療作用,并初步探討其作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、MTT法檢測土槿乙酸在體外對(duì)小鼠臟器細(xì)胞的毒性作用及對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用。
　　 MTT法測定土槿乙酸在體外對(duì)小鼠肝、腎、胸腺及脾淋巴細(xì)胞的毒性作用,對(duì)ConA及LPS分別誘導(dǎo)的小鼠T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖以及混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的抑制作用。
　　 2、觀察土槿乙酸對(duì)小鼠變應(yīng)性接觸性

2、皮炎的作用。
　　 局部外用給藥觀察不同濃度土槿乙酸(0.1％、0.2％、0.4％)對(duì)變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠作用后的體重變化、耳腫脹度、耳腫脹重量差、耳組織形態(tài)學(xué)、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖的影響。
　　 3、RT-PCR法檢測不同濃度土槿乙酸對(duì)變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠作用后脾臟及耳組織中基因T-bet、GATA3、ROR-vt、Stat3、IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β、IL-6、IL-17

3、、IL-17R mRNA表達(dá)的影響。
　　 4、ELISA法檢測不同濃度土槿乙酸對(duì)變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠作用后耳組織細(xì)胞因子IL-6、IL-10、IL-17和TGF-β含量的影響。
　　 5、Western-blot法檢測不同濃度土槿乙酸對(duì)變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠作用后耳組織磷酸化p-38 MAPK(Thr180/Tyr182)、磷酸化Stat3(Ser727)、磷酸化Akt(ser473)及磷酸化NF-κB p65(ser2

4、76)蛋白表達(dá)的影響。
　　 6觀察p-38 MAPK抑制劑對(duì)變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠作用后耳腫脹度、耳腫脹重量差的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1、土槿乙酸的體外活性
　　 MTT法檢測發(fā)現(xiàn)土槿乙酸在體外24h對(duì)小鼠胸腺細(xì)胞幾乎無毒性,IC50＞1mmol/L,優(yōu)于陽性藥地塞米松(0.11μmol/L)、環(huán)孢素(5.23μmol/L)和霉酚酸酯(23.22gmol/L),對(duì)肝腎細(xì)胞表現(xiàn)出較低毒性,IC50為6

5、4.95μmol/L和73.71μmol/l_。在體外24和48h對(duì)脾淋巴細(xì)胞幾乎無毒性,IC50＞10μmol/L,72h IC50為1.82μmol/L,相比于地塞米松的IC50分別為2.59μmol/L、0.93μmol/L和0.74μmol/L。在24、48和72h對(duì)于ConA誘導(dǎo)的脾臟T淋巴細(xì)胞增殖表現(xiàn)出抑制作用且有一定的時(shí)間和劑量依賴性,在48h和72h效果與陽性藥地塞米松相近。對(duì)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中的T細(xì)胞增殖表現(xiàn)出抑制作用

6、且72h作用效果優(yōu)于陽性藥,對(duì)于LPS誘導(dǎo)的脾臟B淋巴細(xì)胞增殖亦表現(xiàn)出抑制作用,但效果皆弱于陽性藥。證明土槿乙酸在體外表現(xiàn)出較明顯的選擇性T細(xì)胞增殖抑制。
　　 2、土槿乙酸對(duì)小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎(ACD)的治療作用
　　 不同濃度土槿乙酸膏劑(0.1％、0.2％、0.4％)多次涂抹于模型小鼠耳部,48h后能緩解炎癥對(duì)體重增加的抑制,中高劑量組與模型組比有顯著性差異(P＜0.05);減小耳腫脹度,24h與48h給藥組與模

7、型組比有顯著性差異(P＜0.05);降低耳腫脹重量、胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù),中高劑量組與模型組比有顯著性差異(P＜0.05);耳組織切片HE染色顯示模型組表皮的棘層和基底層有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤,組織間隙水腫,而中高劑量組能明顯減輕表面損傷,減輕水腫,減少炎癥細(xì)胞浸潤;通過淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證實(shí)中高劑量組能顯著性抑制脾臟T淋巴細(xì)胞增殖(P＜0.05),高劑量能抑制脾臟B淋巴細(xì)胞增殖(P＜0.05),以上證明土槿乙酸在體內(nèi)表現(xiàn)出較好的皮炎治療效果

8、且表現(xiàn)一定的選擇性T細(xì)胞增殖抑制活性。
　　 3、土槿乙酸對(duì)變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠體內(nèi)Th1/Th2平衡的影響
　　 通過RT-PCR檢測小鼠脾臟及耳組織核因子T-bet、Gata3及細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4 mRNA的表達(dá),結(jié)果顯示給藥后能下調(diào)模型組中升高的T-bet、IFN-γ表達(dá),上調(diào)模型組中降低的Gata3、IL-4表達(dá),并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴關(guān)系,表現(xiàn)出藥物對(duì)Th1/Th2平衡的調(diào)節(jié)作用。
　　 4、

9、土槿乙酸對(duì)變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)因子的影響
　　 通過RT-PCR檢測小鼠脾臟及耳組織免疫調(diào)節(jié)因子IL-10、TGF-βmRNA的表達(dá),結(jié)果顯示給藥后能上調(diào)IL-10、TGF-β表達(dá)。ELISA檢測小鼠耳組織細(xì)胞因子IL-10、TGF-β含量,結(jié)果顯示給藥亦能升高兩種因子的的分泌量,并呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系,表明土槿乙酸能夠在ACD小鼠模型中起免疫調(diào)節(jié)作用。
　　 5、土槿乙酸對(duì)變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠體內(nèi)炎癥因子及相

10、關(guān)信號(hào)通路的影響
　　 通過RT-PCR檢測小鼠脾臟及耳組織核因子ROR-vt、Star3、細(xì)胞因子IL-17、IL-6、細(xì)胞因子受體IL-17R mRNA表達(dá),結(jié)果顯示藥物能夠下調(diào)模型中升高的核因子、炎癥因子及受體mRNA的表達(dá)。通過ELISA檢測小鼠耳組織細(xì)胞因子IL-17、IL-6含量,結(jié)果顯示給藥組中兩種因子的分泌量降低,并呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。Western-blot檢測信號(hào)通路蛋白磷酸化p-38MAPK(Thr180/

11、Tyr182)、磷酸化NF-κB p65(ser276)、磷酸化Stat3(ser727)表達(dá),結(jié)果顯示給藥后不同程度抑制模型中升高的相關(guān)蛋白表達(dá),提高模型中降低的磷酸化Akt(ser473)蛋白表達(dá),并呈現(xiàn)出一定劑量依賴關(guān)系。通過4次對(duì)ACD小鼠耳部涂抹p-38 MAPK抑制劑SB203580(0.2％),同時(shí)對(duì)比陽性藥地塞米松(0.075％)、環(huán)孢素(1％)。結(jié)果顯示在24h抑制劑組對(duì)小鼠耳腫脹度的抑制與模型組比有顯著性差異(P＜0

12、.05),與兩陽性藥組無差異,而在48h與模型組和陽性藥組相比都有顯著性差異(P＜0.05)。以上實(shí)驗(yàn)提示土槿乙酸能夠通過作用于相關(guān)信號(hào)通路而抑制ACD。
　　 結(jié)論:土槿乙酸在體外能夠表現(xiàn)出良好的免疫抑制活性,與陽性藥地塞米松、環(huán)孢素、霉酚酸酯相比對(duì)正常細(xì)胞表現(xiàn)更低的毒性,且在體內(nèi)外都顯示對(duì)T細(xì)胞具有一定的選擇性抑制作用。土槿乙酸對(duì)小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎有良好的治療效果,其機(jī)制可能與以下途徑有關(guān):1、調(diào)節(jié)體內(nèi)Th1/Th2平衡:

13、下調(diào)T-bet、IFN-γ基因表達(dá),同時(shí)協(xié)同上調(diào)GATA3、IL-4基因表達(dá)。2、在體內(nèi)產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用:上調(diào)細(xì)胞因子IL-10、TGF-β基因和蛋白的表達(dá)。3、下調(diào)體內(nèi)信號(hào)通路蛋白和細(xì)胞因子表達(dá):下調(diào)ROR-vt、Stat3、IL-17R基因的表達(dá),同時(shí)降低IL-6和IL-17基因和蛋白的表達(dá)。4、通過下調(diào)Star3、MAPK、NF-κB三條信號(hào)通路和上調(diào)Akt信號(hào)通路協(xié)同作用。
　　 因此,土槿乙酸是一個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán),新