維藥異常黑膽質(zhì)成熟劑對(duì)增生性瘢痕影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、瘢痕（Scar）是機(jī)體創(chuàng)傷愈合的必然產(chǎn)物。病理性瘢痕由于瘢痕增生過(guò)度，從而引起外形和（或）功能異常。增生性瘢痕（Hypertrophic Scar, HS）是臨床最常見(jiàn)的病理性瘢痕之一，造成患者外觀畸形和功能異常，給患者身體及心理帶來(lái)了較大的影響。由于其具體機(jī)制尚不十分清楚，且治療后易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，當(dāng)前尚無(wú)較好的防治手段。增生性瘢痕的形成是多環(huán)節(jié)、多階段的一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，包括凝血、早期炎癥、晚期炎癥、成纖維細(xì)胞的遷移與膠原的合成、血管化、上

2、皮化、重塑階段等。傳統(tǒng)治療方法包括局部加壓、激素注射、硅凝膠類以及放化療等雖然取得了一定效果，但在治療HS的同時(shí)，會(huì)出現(xiàn)副作用或不良反應(yīng)，臨床應(yīng)用受到一定限制。
　　在傳統(tǒng)中醫(yī)理論中，HS認(rèn)為是由于氣血壅滯、經(jīng)絡(luò)痹阻、痰濕搏結(jié)或三者聯(lián)合所致，且基于活血化瘀、攻毒散結(jié)、通絡(luò)止痛、酸澀收斂和消結(jié)散瘢等方法在增生性瘢痕的防治上取得了一定進(jìn)展。雖然目前報(bào)道的中醫(yī)治療瘢痕的方法很多，但多數(shù)存在用藥途徑比較單一、劑型有限、多集中在單味藥物或是

3、提取物研究等缺陷，且療效不確切，容易復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)。
　　維醫(yī)理論認(rèn)為體液是人類生命及生理活動(dòng)過(guò)程的基本物質(zhì)體內(nèi)各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在肝中產(chǎn)生的各種液體總稱為體液，分為膽液質(zhì)、血液質(zhì)、粘液質(zhì)和黑膽質(zhì)四種。它們貫穿于整個(gè)人生，在體內(nèi)自然形成，對(duì)健康和疾病起很大的作用。它們?cè)隗w內(nèi)不斷地消耗，又不斷地產(chǎn)生，保持著一定的平衡狀態(tài)。四體液脫離自然的正常狀態(tài)，在數(shù)量和質(zhì)量上發(fā)生改變，成為對(duì)人體無(wú)益或有損的體液，稱為異常體液。在體內(nèi)外各種因素的作用下，人體

4、內(nèi)膽質(zhì)體液的量增加，功能改變，在機(jī)體基礎(chǔ)“熱”的作用下“燃燒”最終形成異常黒膽質(zhì)，是許多疾病維吾爾醫(yī)學(xué)病理生理上所共有的特性。治療上主要采用異常黒膽質(zhì)成熟劑（Abnormal Savda Munziq，ASMq）進(jìn)行調(diào)整。ASMq在防治部分腫瘤、糖尿病、高血壓等方面均取得了一定效果。體外研究顯示ASMq具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡等作用。研究表明皮膚增生性瘢痕是由于成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)膠原過(guò)度沉積所引起，又被稱為“皮膚

5、成纖維細(xì)胞良性腫瘤”。本研究在傳統(tǒng)維醫(yī)理論指導(dǎo)下提出科學(xué)假設(shè)：皮膚增生性瘢痕是異常黒膽質(zhì)體液在皮膚的局部沉積所致，是全身異常黒膽質(zhì)體液的局部表現(xiàn)。本研究擬通過(guò)兔耳增生性瘢痕動(dòng)物模型以及體外人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)采用不同濃度 ASMq干預(yù)研究，來(lái)檢驗(yàn)假設(shè)，并進(jìn)一步探討其細(xì)胞與分子機(jī)制。
　　研究表明，增生性瘢痕是由于成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)膠原過(guò)度沉積所引起，其中TGF-β是導(dǎo)致增生性瘢痕形成的重要細(xì)胞因子，它

6、主要通過(guò)TGF-β/Smad信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的增殖，凋亡，遷移和膠原代謝。TGF-β能同時(shí)觸發(fā)兩個(gè)可以對(duì)抗Smad蛋白介導(dǎo)的正反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，其中就是快速激活Smad7啟動(dòng)子，誘導(dǎo)Smad7基因表達(dá)，通過(guò)Smad7競(jìng)爭(zhēng)性的占據(jù)TGF-βI型受體，抑制受體的蛋白激酶R-TGF-β的磷酸化而阻斷信號(hào)傳導(dǎo)，最后誘發(fā)它能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)在傷口沉積，并能促進(jìn)纖維化，促使形成增生性瘢痕。
　　由于增生性瘢痕是成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖和細(xì)胞外膠

7、原機(jī)制過(guò)度沉積而引起，因此抑制成纖維細(xì)胞增殖、抑制其膠原表達(dá)是防治增生性瘢痕的基礎(chǔ)。在細(xì)胞水平上，通過(guò)抑制細(xì)胞活性從而抑制成纖維細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡可以減少瘢痕內(nèi)成纖維細(xì)胞數(shù)量，可以在一定程度上防治增生性瘢痕；在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)中，改變細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、線粒體等與膠原表達(dá)關(guān)系密切的亞細(xì)胞器活性可以在一定程度上具有減少瘢痕膠原的沉積的作用；在蛋白分子水平上，由于TGF-β/Smad信號(hào)通路是膠原產(chǎn)生的主要通路之一，且TGFβ1是促進(jìn)細(xì)胞

8、增殖的重要因子之一，因此通過(guò)減少TGFβ1的表達(dá)、增加Smad7的表達(dá)可以防治增生性瘢痕的發(fā)生和發(fā)展。
　　目的：
　　通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)初步探討維藥ASMq對(duì)增生性瘢痕的影響及其作用機(jī)制，為臨床采用維醫(yī)維藥理論防治增生性瘢痕提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　方法：
　　本研究采用兔耳瘢痕動(dòng)物模型、體外增生性瘢痕成纖維細(xì)胞培養(yǎng)等途徑，分別從組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)以及分子生物學(xué)水平，探討維藥 ASMq對(duì)增生性瘢痕的影響及其作用機(jī)制。

9、第一部分，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分，灌胃給予維藥ASMq對(duì)兔耳增生性瘢痕影響的實(shí)驗(yàn)研究。20只新西蘭大耳白兔采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，即空白對(duì)照組（生理鹽水）三個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別為：（ASMq400 mg/kg)、（ASMq800 mg/kg）、（ASMq1200 mg/kg），每組5只。在創(chuàng)面形成后第45天（預(yù)實(shí)驗(yàn)表明此時(shí)瘢痕增生達(dá)到峰值），分別取材后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定，備好切片后進(jìn)行四項(xiàng)實(shí)驗(yàn)實(shí)施。
　?。?）通過(guò)計(jì)算瘢痕增生指數(shù)（Hypert

10、rophic Indes, HI），與空白對(duì)照組相比，從而明確各實(shí)驗(yàn)組ASMq對(duì)兔耳增生性瘢痕有無(wú)影響。
　　（2）通過(guò)對(duì)各組創(chuàng)面范圍內(nèi)組織切片行HE染色，觀察各組兔耳瘢痕膠原排列以及成纖維細(xì)胞密度等情況，進(jìn)一步明確ASMq對(duì)兔耳增生性瘢痕膠原增生以及成纖維細(xì)胞增殖的影響。
　　（3）通過(guò)對(duì)各組創(chuàng)面范圍內(nèi)組織行 Masson染色，觀察各組膠原排列以及膠原密度，通過(guò)采用單因素方差分析分析多組間膠原面密度，通過(guò)兩兩比較 q檢驗(yàn)，

11、明確各組間膠原面密度有無(wú)差異。
　　（4）通過(guò)對(duì)兔耳創(chuàng)面范圍內(nèi)組織標(biāo)本通過(guò)透射電鏡觀察組織超微結(jié)構(gòu)（包括原膠原纖維、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)），通過(guò)與空白對(duì)照組相比較分析，初步在超微結(jié)構(gòu)層面進(jìn)一步觀察不同濃度維藥ASMq對(duì)兔耳增生性瘢痕的影響機(jī)制。第二部分，體外實(shí)驗(yàn)，通過(guò)體外分離培養(yǎng)人增生性瘢痕來(lái)源成纖維細(xì)胞，分四組（1個(gè)空白對(duì)照組，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組）：空白對(duì)照組，低濃度ASMq組（0.1mg/ml），中濃度ASMq組（0.4mg/m

12、l），高濃度ASMq組（0.7mg/ml）。對(duì)各組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)：
　?。?）通過(guò)CCK-8方法，采用酶標(biāo)儀檢測(cè) ASMq對(duì)成纖維細(xì)胞體外增殖有無(wú)影響。
　?。?）采用細(xì)胞凋亡分析試劑盒通過(guò)流式細(xì)胞分析儀行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，擬明確不同濃度 ASMq對(duì)成纖維細(xì)胞凋亡的影響。
　?。?）采用細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析ASMq對(duì)成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期的影響，擬明確ASMq阻斷細(xì)胞增殖周期的具體時(shí)間點(diǎn)。

13、>　　（4）通過(guò)細(xì)胞劃痕遷移實(shí)驗(yàn)觀察成纖維細(xì)胞遷移能力，擬明確不同濃度ASMq對(duì)成纖維細(xì)胞遷移能力有無(wú)影響。
　?。?）通過(guò)透射電鏡觀察成纖維細(xì)胞合成原膠原能力以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、細(xì)胞核、線粒體等細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)情況，擬明進(jìn)一步分析明確不同濃度 ASMq對(duì)成纖維細(xì)胞表達(dá)膠原以及細(xì)胞凋亡、增殖的機(jī)制。第三部分，采用RT-PCR方法和免疫印跡等方法基于TGFβ/Smad通路分析ASMq對(duì)增生性瘢痕來(lái)源成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖、膠原表達(dá)影響的分子機(jī)

14、制。擬明確不同濃度 ASMq對(duì)增生性瘢痕來(lái)源成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖、膠原表達(dá)的分子機(jī)制。結(jié)果：第一部分，體內(nèi)兔耳增生性瘢痕動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，灌胃給藥ASMq可以在一定程度上抑制增生性瘢痕的發(fā)生發(fā)展，且在一定濃度范圍內(nèi)具有濃度梯度依賴性。
　?。?）大體觀察結(jié)果，增生性瘢痕的厚度隨著ASMq的濃度逐漸增大，其厚度逐漸減小，硬度逐漸軟化，體積逐漸減小，趨于平復(fù)，顏色逐漸變淡。
　　（2）計(jì)算瘢痕增生指數(shù)結(jié)果，與空白組（3.87±

15、0.22）對(duì)比，實(shí)驗(yàn)各組分別為（3.38±0.34）、（2.63±0.15）、（1.72±0.12）增生性指數(shù)（HI）隨著ASMq的濃度逐漸增加而降低（p<0.05）。
　?。?）通過(guò)HE染色在1200 mg/kg濃度維藥ASMq灌胃后對(duì)瘢痕增生的成纖維細(xì)胞密度觀察結(jié)果，與空白組（4022.5±189.3)相比，實(shí)驗(yàn)組(3541.4±206.6)的顯示瘢痕增生不明顯，成纖維細(xì)胞數(shù)量及密度減少（p<0.05）。
　?。?）通過(guò)

16、Masson染色在1200 mg/kg濃度維藥ASMq灌胃后對(duì)瘢痕增生的膠原纖維情況觀察結(jié)果，與空白組（42.25±2.58）相比，實(shí)驗(yàn)組(23.55±1.28)的增生性瘢痕膠原纖維面密度明顯減少（p<0.05）。
　?。?）通過(guò)透射電鏡觀察不同濃度的ASMq對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果；與空白組對(duì)比，隨著實(shí)驗(yàn)組濃度的遞增成纖維細(xì)胞密度和膠原纖維面密度逐漸減少。第二部分，體外增生性瘢痕來(lái)源成纖維細(xì)胞干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在

17、一定濃度范圍內(nèi)ASMq具有抑制成纖維細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用；細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示ASMq具有抑制成纖維細(xì)胞原膠原合成，抑制細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、線粒體等）活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡等作用。生物學(xué)特性的影響。
　?。?）體外細(xì)胞培養(yǎng)原代和傳代及細(xì)胞凍存和復(fù)蘇情況結(jié)果，成纖維細(xì)胞界限清楚，胞體較大，呈棱形或不規(guī)則三角形，細(xì)胞質(zhì)向外伸出兩三個(gè)長(zhǎng)短不同的突起，胞漿豐富、胞膜邊界清晰、核仁多以成雙出現(xiàn)大小均等。
　　（2）用

18、CCK-8法檢測(cè)各組 HSFs增殖活性結(jié)果，與空白對(duì)照組相比，不同濃度ASMq組以及陽(yáng)性對(duì)照組5-Fu組的HSFs增值活性明顯降低，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　?。?）用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組 HSFs細(xì)胞凋亡結(jié)果，與空白對(duì)照組凋亡率為2.2％±0.59%，不同濃度ASMq實(shí)驗(yàn)組凋亡率分別為14.1%±3.87%，23.5%±3.22%，38.8%±3.14%,43.7%±2.58%；ASMq組凋亡率明顯高于對(duì)照組，且

19、凋亡率隨ASMq濃度增加呈遞增趨勢(shì)。
　?。?）ASMq對(duì)HSFs細(xì)胞周期的影響結(jié)果，與空白對(duì)照組比較，不同濃度ASMq組HSFs在G2/M期細(xì)胞比例呈不同程度升高，具有濃度依賴性，即在0.1~1.0mg/ml濃度間，隨著ASMq濃度增加，G2/M期細(xì)胞比例從13.1%增加到29.5%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　?。?）ASMq干預(yù)增生性瘢痕來(lái)源的成纖維細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與空白組相比，實(shí)驗(yàn)組分別在0h、24h、

20、48h后，增生性瘢痕的成纖維細(xì)胞遷移能力隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減弱（p<0.05）。
　?。?） ASMq對(duì)HSFs超微結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果，從低倍和高倍鏡觀察到：0.4mg/ml組的成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核消失；0.7mg/ml組成纖維細(xì)胞膜出現(xiàn)收縮；1mg/ml組成纖維細(xì)胞出現(xiàn)凋亡小體相對(duì)空白組。第三部分，通過(guò)體外對(duì)不同濃度ASMq干預(yù)后的增生性瘢痕來(lái)源成纖維細(xì)胞基于TGFβ/Smad通路分析，結(jié)果顯示ASMq可以抑制TGFβ1的表達(dá)，促進(jìn)

21、抑制型Smad7的表達(dá)。在分子生物水平方面，通過(guò)RT-PCR的檢測(cè)方法和western-blot檢測(cè)方法。
　?。?）ASMq對(duì)成纖維細(xì)胞TGF-β1mRNA表達(dá)的影響結(jié)果，與空白組對(duì)比，AMSq隨著藥物濃度的增加，TGF-β1mRNA表達(dá)量減少(P<0.05)。
　?。?）ASMq對(duì)成纖維細(xì)胞Smad7mRNA表達(dá)的影響結(jié)果，與空白組對(duì)比，ASMq隨著藥物濃度的增加Smad7mRNA表達(dá)量增加(P<0.05)。
　　

22、（3）ASMq對(duì)成纖維細(xì)胞TGF-β1蛋白表達(dá)的影響結(jié)果，與空白組對(duì)比，ASMq隨著藥物濃度的增加，TGF-β1蛋白表達(dá)量減少(P<0.05)。
　?。?）ASMq對(duì)成纖維細(xì)胞Smad7蛋白表達(dá)的影響結(jié)果，與空白組對(duì)比，ASMq隨著藥物濃度的增加Smad7蛋白表達(dá)量增加(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　灌胃給藥ASMq可以在一定程度上抑制兔耳增生性瘢痕的發(fā)生發(fā)展，且在一定濃度范圍內(nèi)具有濃度梯度依賴性，其通過(guò)抑制膠原合

23、成和成纖維細(xì)胞增殖途徑發(fā)揮作用。在一定濃度范圍內(nèi)，ASMq具有抑制人增生性瘢痕來(lái)源成纖維細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用；細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示ASMq具有抑制成纖維細(xì)胞原膠原合成，抑制細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、線粒體等）活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡等作用。ASMq可以抑制人增生性瘢痕來(lái)源成纖維細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)，促進(jìn)抑制型Smad7的表達(dá)。綜上表明ASMq可以基于TGFβ/Smad通路抑制成纖維細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及抑制膠原表達(dá)，從而