CCL21-CCR7在結腸癌侵襲與轉移過程中生物學意義的研究.pdf

1、華中科技大學博士學位論文CCL21CCR7在結腸癌侵襲與轉移過程中生物學意義的研究姓名：孫仁虎申請學位級別：博士專業(yè)：外科學（普外）指導教師：王國斌20090501華中科技大學博士學位論文華中科技大學博士學位論文4第二部分第二部分CCR7shRNA表達載體的構建表達載體的構建及對及對SW480細胞的沉默效應細胞的沉默效應目的：設計并構建靶向CCR7基因短發(fā)夾RNA(shthairpinRNAshRNA)真核表達質粒，并檢測其對人結腸癌S

2、W480細胞中CCR7表達的干擾效果。方法：以CCR7為靶基因設計具有短發(fā)夾結構的模板寡核苷酸，退火形成互補雙鏈結構，再克隆至pGCsilencerCRM30載體，構建的3條重組shRNA真核表達質粒分別命名為pGCsilencerCRM30_CCR7A、_CCR7B和_CCR7C。采用測序法鑒定寡核苷酸序列。將構建好的3條shRNA真核表達質粒轉染人結腸癌SW480細胞，熒光顯微鏡觀察轉染效果，RTPCR法檢測CCR7mRNA干擾效果

3、，優(yōu)化轉染條件，以實現最佳干擾效果；選取干擾效果最佳的1條shRNA真核表達質粒轉染SW480細胞，并通過G418篩選穩(wěn)定表達CCR7shRNA的細胞株。結果：重組質粒測序結果與Genebank中的CCR7cDNA序列相符，轉染SW480細胞后，熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光蛋白；RTPCR結果顯示，pGCsilencerCRM30_CCR7C干擾效果最強。將pGCsilencerCRM30_CCR7C轉染SW480細胞，并通過G418篩