CCL21-CCR7誘導(dǎo)血管生成擬態(tài)形成在肝門部膽管癌術(shù)后微轉(zhuǎn)移中的作用及其機制.pdf

1、研究背景：
　　 肝門部膽管癌是指原發(fā)于膽囊管開口以上的肝總管至左、右肝管部位的粘膜上皮癌，占肝外膽管癌的58-75％。由于肝門部空間狹小、與血管關(guān)系密切以及腫瘤浸潤性生長的特點，手術(shù)切除率低、根治性切除率更低。但是，即使行根治性切除術(shù)后(切緣及周圍組織常規(guī)病理檢查無瘤細胞殘余)，肝門部膽管癌復(fù)發(fā)率依然很高，且主要是肝臟和肝門區(qū)的轉(zhuǎn)移。因此推測微轉(zhuǎn)移可能是其主要原因，且多項研究表明微轉(zhuǎn)移是腫瘤預(yù)后的獨立因素。因此發(fā)現(xiàn)能遏制或減少

2、微轉(zhuǎn)移的治療方法是提高肝門部膽管癌治愈率的關(guān)鍵因素。
　　 微轉(zhuǎn)移是指常規(guī)臨床病理學(xué)方法不能檢出的非血液系統(tǒng)惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移，是離開原發(fā)灶的鏡檢(<2mm)癌細胞沉積，在逃避免疫監(jiān)視后侵犯血管并發(fā)展成肉眼可見的病變，常無任何臨床表現(xiàn)。血管生成擬態(tài)是一種與經(jīng)典腫瘤血管生成途徑不同，不依賴于機體內(nèi)皮細胞的全新腫瘤微循環(huán)模式，腫瘤微轉(zhuǎn)移的一種重要途徑。對于肝門部膽管癌，Thelen等研究發(fā)現(xiàn)腫瘤血管的生成與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部復(fù)發(fā)有關(guān)，并且

3、是影響肝門部膽管癌術(shù)后生存率的重要因素。Aishima等研究結(jié)果顯示腫瘤血管密度的增加促進了肝門部膽管癌的淋巴轉(zhuǎn)移和血管浸潤。而血管生成擬態(tài)是根治術(shù)(切緣鏡檢無癌細胞)后馬賽克血管、血管內(nèi)皮細胞血管形成的前提和基礎(chǔ)。
　　 SLC是1997年由Nagria首次報道，屬于CC類趨化因子。人SLC cDNA序列包括847個堿基，編碼134個氨基酸殘基，與其他趨化因子有21％～33％的同源性。SLC的基因定位于9p13，有4個外顯子和

4、3個內(nèi)含子組成。SLC有活化的T淋巴細胞、內(nèi)皮細胞等產(chǎn)生，高表達于次級淋巴組織，特別是高內(nèi)皮小靜脈(high endothelialvenule，HEV)和淋巴結(jié)T細胞區(qū)。SLC包括CCL21和ICCL19，CCL21在淋巴結(jié)的表達量更高，提示CCL21在淋巴細胞的歸巢中起重要作用。CCR7是1998年由Yashida在EB病毒感染的B細胞中發(fā)現(xiàn)的，是SLC的高親合力受體。含378個氨基酸殘基，基因定位于17q12～q21.2。主要在幼

5、稚T細胞、B細胞和樹突狀細胞表面，在記憶T細胞、NK細胞和NKT細胞也有表達。在腫瘤常見轉(zhuǎn)移部位高水平表達CCL21，提示CCL21與CCR7很可能參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移與侵襲，并且認為CCR7的高表達和對CCL21的劑量依賴趨化性可能決定了腫瘤轉(zhuǎn)移的方向和部位。CCL21-CCR7生物學(xué)軸在腫瘤淋巴歸巢、血管生成及神經(jīng)浸潤方面有一定的作用。并且可以調(diào)控其它趨化因子的分泌。
　　 我們采用肝門高位切除并肝門實質(zhì)-空腸吻合術(shù)做到擴大手術(shù)

6、切除范圍，盡量減少微轉(zhuǎn)移的發(fā)生；對肝門部膽管癌組織進行了CCR7的檢測，表明CCR7在腫瘤組織中高表達，在此基礎(chǔ)上我們(1)從臨床研究：肝門高位切除并肝門實質(zhì)-空腸吻合術(shù)的解剖學(xué)基礎(chǔ)、與傳統(tǒng)術(shù)式的優(yōu)缺點比較、在較少微轉(zhuǎn)移方面的優(yōu)勢以及需要改進的設(shè)想。(2)從基礎(chǔ)研究：肝門部膽管癌是否存在血管生成擬態(tài)?CCL21-CCR7生物學(xué)軸是否誘導(dǎo)血管生成擬態(tài)形成促進了肝門部膽管癌微轉(zhuǎn)移?誘導(dǎo)血管生成擬態(tài)形成的機制如何?總之，從基礎(chǔ)和臨床相結(jié)合探討

7、較少肝門部膽管癌微轉(zhuǎn)移方法，提高根治性切除率，減少術(shù)后復(fù)發(fā)率，延長病人生存時間，提高生存質(zhì)量。
　　 第一部分肝門高位切除、肝門實質(zhì)-空腸吻合術(shù)在BismuthⅣ型肝門部膽管癌手術(shù)中的應(yīng)用
　　 目的：
　　 探討肝門高位切除、肝門實質(zhì)-空腸吻合術(shù)在治療BismuthⅣ型肝門部膽管癌中的作用。
　　 方法：
　　 選取2004年3月至2011年6月期間治療的32例行根治性切除的BismuthⅣ型肝

8、門部膽管癌進行回顧性分析。按治療方式分為新術(shù)式組(n=16)和傳統(tǒng)術(shù)式組(n=16)。新術(shù)式組采用肝門高位切除、肝門空腸吻合術(shù)，傳統(tǒng)術(shù)式組采用膽管整形后膽管空腸吻合術(shù)，兩組病人均達到R0根治(切緣無癌細胞)。對兩組病人手術(shù)時間、術(shù)中出血量、住院天數(shù)以及術(shù)后并發(fā)癥、生存質(zhì)量、生存率進行比較。
　　 結(jié)果：
　　 與傳統(tǒng)術(shù)式組比較，新術(shù)式組的手術(shù)時間(t=2.52，p<0.05)、伴肝葉或段切除數(shù)(x2=6.30，p<0.0

9、5)和住院天數(shù)(t=3.18，p<0.05)明顯減少；兩組之間比較術(shù)中出血量(t=1.09，p>0.05)、生存質(zhì)量(t=0.68，p>0.05)和總體并發(fā)癥的發(fā)生率(x2=0.65，p>0.05)無顯著性差異，但是膽漏的發(fā)生率新術(shù)式組明顯低于傳統(tǒng)術(shù)式組(x2=5.09，p<0.05)，而膽道感染的發(fā)生率新術(shù)式組明顯于傳統(tǒng)術(shù)式組(x2=4.43，p<0.05)；通過log-rank檢驗發(fā)現(xiàn)兩組之間生存率比較有顯著性差異(x2=19.10

10、，p<0.05)，新術(shù)式組在1、3、5年的生存率明顯高于傳統(tǒng)術(shù)式組。
　　 結(jié)論：
　　 采用肝門高位切除、肝門實質(zhì)-空腸吻合術(shù)治療BismuthⅣ型肝門部膽管癌可提高手術(shù)切除率、減少肝實質(zhì)切除量、利于膽道通暢引流，從而延長患者生存時間，提高病人生存質(zhì)量。
　　 意義：
　　 肝門高位切除、肝門實質(zhì)-空腸吻合術(shù)簡化了肝門部膽管癌手術(shù)過程，減少了接觸性轉(zhuǎn)移，提高了手術(shù)切除率和病人生存率，是值得推廣的新的手術(shù)

11、方式。
　　 第二部分趨化因子受體CCR7和血管生成擬態(tài)在肝門部膽管中的表達及其意義
　　 目的：
　　 探討趨化因子受體CCR7和血管生成擬態(tài)在肝門部膽管癌組織和細胞中的表達及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
　　 方法：
　　 免疫組織化學(xué)染色檢測63例肝門部膽管癌手術(shù)標(biāo)本和20例正常膽管組織CCR7的表達，PAS和CD34雙重染色檢測肝門部膽管癌組織中血管生成擬態(tài)的表達，將CCR7表達和VM形成與臨

12、床病理參數(shù)進行相關(guān)性分析；RT-PCR和Westernblot檢測QBC939細胞中CCR7的表達：三維細胞培養(yǎng)檢測QBC939細胞中血管生成擬態(tài)形成。
　　 結(jié)果：
　　 63例肝門部膽管癌組織中，CCR7陽性表達50例、陽性率79.4％。正常膽管中有2例表達弱陽性，陽性率10％，遠低于肝門部膽管癌組織，差異具有顯著性；在63例肝門部膽管癌組織標(biāo)本中25例存在血管生成擬態(tài)形成，正常組織中無Vm形成；并且所有20例低分化

13、的肝門部膽管癌中Vm全部陽性，另外在25例中分化肝門部膽管癌中5例存在Vm陽性；與臨床病例參數(shù)相關(guān)性分析，CCR7和Vm在肝門部膽管癌中的表達與腫瘤的分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著性相關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤的大小、組織學(xué)類型和有無肝切除無關(guān)；單變量和多變量相關(guān)性分析CCR7、Vm、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與生存率有關(guān)，而CCR7是影響肝門部膽管癌生存率的獨立性因素。RT-PCR和Western-Blot結(jié)果證實在QBC939細胞中存在CCR7

14、的表達，與組織標(biāo)本的檢測結(jié)果一致，并且發(fā)現(xiàn)QBC939細胞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)一血管生成擬態(tài)的能力。
　　 結(jié)論：
　　 在肝門部膽管癌組織標(biāo)本和膽管癌細胞中均存在CCR7和血管生成擬態(tài)的表達，兩者有正相關(guān)關(guān)系；CCR7和血管生成擬態(tài)的表達與肝門部膽管癌患者的血淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分化程度有關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤的大小、組織學(xué)類型和有無肝切除無關(guān)；CCR7是影響肝門部膽管癌生存率：的獨立性因素。
　　 意義
　　

15、揭示了血管生成擬態(tài)形成在肝門部膽管癌微轉(zhuǎn)移過程中起著非常重要的作用；CCR7可能通過血管生成擬態(tài)形成、淋巴轉(zhuǎn)移途徑誘導(dǎo)肝門部膽管癌的微轉(zhuǎn)移。
　　 第三部分 CCR7及CCR7-shRNA載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及效應(yīng)細胞的篩選
　　 目的：
　　 構(gòu)建CCR7高表達和CCR7-shRNA的真核表達載體，并轉(zhuǎn)染至QBC939細胞，獲得CCR7高表達、正常表達和低表達的穩(wěn)定細胞株。
　　 方法：
　　 從QB

16、C939細胞中提取總RNA，設(shè)計CCR7引物應(yīng)用RT-PCR得到CCR7產(chǎn)物；通過酶切反應(yīng)，獲得Insert DNA和Vector DNA，連接轉(zhuǎn)化得到熒光CCR7質(zhì)粒。同樣，根據(jù)shRNA設(shè)計原則，采用慢病毒表達載體構(gòu)建，設(shè)計shRNA特異性序列后、以RNA聚合酶Ⅲ依賴的啟動子U6引導(dǎo)shRNA-CCR7和綠色熒光蛋白(greenflurescence protein，GFP)的共同轉(zhuǎn)錄，來操縱一段小發(fā)夾siRNA在QBC939細胞中

17、的表達。通過三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，制備表達攜帶CCR7不同表達的慢病毒質(zhì)粒的慢病毒液。這些慢病毒液直接感染QBC9393細胞。最后用足夠劑量的Puromycin殺死非轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞。
　　 結(jié)果：
　　 對CCR7-pEGFP質(zhì)粒進行DNA序列測定，測序結(jié)果與與實驗設(shè)計合成的CCR7靶基因序列完全一致；將CCR7-shRNA質(zhì)粒進行DNA序列測定，測序結(jié)果與與實驗設(shè)計合成的shCCR7靶基因序列完全一致。將通過慢病毒轉(zhuǎn)染

18、得到的pEGFP細胞、CCR7-pEGFP細胞和CCR7-shRNA-pEGFP細胞應(yīng)用RT-PCR和Western-Blot檢測CCR7的表達結(jié)果顯示，與pEGFP正常對照組相比，CCR7-pEGFP高表達組CCR7表達水平明顯增強；而CCR7-shRNA-pEGFP沉默組CCR7mRNA的水平表達微弱。
　　 結(jié)論：
　　 成功合成了熒光標(biāo)記的高表達CCR7質(zhì)粒和CCR7-shRNA質(zhì)粒，通過慢病毒轉(zhuǎn)染最終得到了pE

19、GFP、CCR7-pEGFP和CCR7-shRNA-pEGFP三組細胞株。
　　 意義：
　　 為下一步研究CCR7高表達、正常表達和低表達對QBC939細胞VM形成、增殖、遷移、侵襲能力的影響提供保證。
　　 第四部分趨化因子受體CCR7誘導(dǎo)血管生成擬態(tài)形成在肝門部膽管癌微轉(zhuǎn)移中的作用及其機制
　　 目的：
　　 探討趨化因子受體CCR7誘導(dǎo)血管生成擬態(tài)形成促進了QBC939細胞的增殖、遷移和侵

20、襲以及CCR7發(fā)揮作用的信號途徑。
　　 方法：
　　 根據(jù)實驗方法的需要，在培養(yǎng)基中含或不含CCL21將CCR7不同表達的三組細胞株分為六組：(1)pEGFP組；(2)CCR7-pEGFP組；(3)CCR7-shRNA-pEGFP；(3)pEGFP+CCL21組；(5)CCR7-pEGFP+CCL21組；(6)CCR7-shRNA-pEGFP+CCL21組。應(yīng)用三維細胞培養(yǎng)檢測各組QBC939細胞中血管生成擬態(tài)形成；細

21、胞劃痕實驗和Transwell小室檢測各組細胞的遷移能力；Boyden小室檢測CCL21-CCR7對QBC939細胞體外侵襲能力的影響；應(yīng)用MTT法檢測CCL21-CCR7對QBC939細胞增殖能力的影響。最后Real time PCR檢測三組細胞株中CCR7及相關(guān)6個基因wist1＼GAPDH＼IL-8＼VEGF＼PDEF＼PDCD4的表達。
　　 結(jié)果：
　　 與對照組相比，CCR7高表達組形成VM能力和細胞增殖明顯

22、增強，而在CCR7沉默表達組形成VM和細胞增殖能力減弱，三組不同CCR7表達組加入CCL21形成VM和細胞增殖能力沒有變化。劃痕實驗、Transwell小室和Boyden小室測定各組CCR7不同表達的QBAC939細胞的運動、遷移和侵襲能力得到的結(jié)果一致，與對照組相比，CCR7高表達組爬行能力、穿膜細胞數(shù)量明顯增加，而CCR7沉默組爬行能力、穿膜細胞數(shù)量明顯減少；在對照組和CCR7高表達組加入CCL21后爬行能力、穿膜細胞數(shù)量明顯增加，

23、而在CCR7沉默表達組加入CCL21后，爬行能力和穿膜細胞數(shù)量沒有明顯變。對三組細胞應(yīng)用CCR7引物和Twist1＼GAPDH＼IL-8＼VEGF＼PDEF＼PDCD46個基因的引物進行qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，Twist1基因在三組細胞中的變化趨勢同CCR7的變化一致，即在CCR7高表達組同時也高表達Twist1，而在CCR7沉默組Twist1基因也低表達。
　　 結(jié)論：
　　 CCL21-CCR7生物學(xué)軸的不同表達影響了血管

24、生成擬態(tài)的形成，從而使膽管癌細胞的增殖能力、遷移和侵襲能力改變；CCR7影響VM形成、細胞增殖、遷移和侵襲的信號途徑可能是通過Twist1的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化來實現(xiàn)的。
　　 意義：
　　 CCL21/CCR7相互作用引起Twist1的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化可能是肝門部膽管癌形成VM促進微轉(zhuǎn)移的重要機制之一。在積極針對原發(fā)腫瘤治療的同時，應(yīng)用趨化因子及其受體間相互作用阻斷劑，加上其導(dǎo)致微轉(zhuǎn)移信號途徑中的Twist1、VM等阻斷劑的協(xié)