三種免疫細胞聯(lián)合治療結(jié)直腸癌的臨床效應及機制研究.pdf

1、研究背景:盡管結(jié)直腸癌患者的預后較其他消化道腫瘤好,但仍有相當一部分病例術(shù)后復發(fā)或轉(zhuǎn)移。手術(shù)只能清除肉眼所見腫塊,放療及化療也不能將腫瘤細胞斬盡殺絕,這三種傳統(tǒng)治療方法的實施均對機體的抗腫瘤免疫功能造成一定的抑制和損傷。而免疫治療作為新興的腫瘤治療的第四大手段已經(jīng)在實體腫瘤治療中使患者受益。荷載腫瘤抗原的樹突狀細胞(DendriticCells,DCs)、樹突狀細胞致敏的T淋巴細胞(DC-activatedT,DC-AT)和活化的T淋巴

2、細胞(activatedTcells,ATC)作為免疫治療的重要部分,已經(jīng)在臨床治療中得到應用,但聯(lián)合三種免疫細胞在圍手術(shù)期通過不同路徑不同時間序貫回輸體內(nèi)治療結(jié)直腸癌未見臨床報道。T淋巴細胞作為三種免疫細胞聯(lián)合治療的主要效應細胞,可特異性識別腫瘤,呈克隆化擴增,并在體內(nèi)形成免疫記憶,可介導持久抗腫瘤特異性免疫。關(guān)于T淋巴細胞回輸人體內(nèi)后通過克隆化擴增和形成免疫記憶來重建抗腫瘤特異性免疫的相關(guān)機制亦是未見報道。
　　目的:通過前瞻

3、性臨床隊列研究觀察三種免疫細胞聯(lián)合治療結(jié)直腸癌的臨床效應,建立動態(tài)觀察結(jié)直腸癌患者免疫治療前及治療后T細胞受體(Tcellreceptor,TCR)CDR3(Complementarydeterminingregion,CDR)區(qū)基因克隆化程度和T淋巴細胞免疫記憶狀態(tài)的技術(shù)平臺,評價特異性抗腫瘤免疫功能重建程度,探討免疫細胞抗腫瘤效應的長效機制。
　　方法:1)選取2005年7月至2011年7月解放軍總醫(yī)院253例行結(jié)直腸癌根治術(shù)

4、的II、III和IV期患者,按照治療方式不同,將181例單純術(shù)后輔助化療患者設為對照組,72例術(shù)后輔助化療聯(lián)合DCs、DC-AT和ATC免疫治療患者設為免疫治療組。對兩組患者定期隨訪,截至于2012年7月。采用Kaplan–Meier生存分析法比較兩組5年生存率并繪制生存曲線,進一步分析免疫治療頻次對免疫治療療效的影響,并觀察免疫細胞治療過程中有無不良反應。2)選取3例進行免疫治療的結(jié)直腸癌患者,采集免疫治療前及治療后3個月的外周血。以

5、流式細胞術(shù)檢測外周血中央型記憶T細胞和效應型記憶T細胞比例,評估免疫治療后體內(nèi)形成的T細胞免疫記憶狀態(tài);用磁珠從外周血分離的PBMC中分離CD4+、CD8+T細胞,分別提取CD4+/CD8+T細胞中RNA并進行逆轉(zhuǎn)錄,應用TCRCDR3多態(tài)性及克隆化可視化和定量化檢測技術(shù)對逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行巢式PCR,對產(chǎn)物進行基因掃描,獲得免疫治療前后TCRCDR3基因掃描譜;同時對PCR產(chǎn)物進行電泳,獲得TCRCDR3基因電泳譜,選取免疫治療前后持續(xù)表

6、達的Vβ2和治療后出現(xiàn)的Vβ11單克隆條帶進行切膠純化;將純化的PCR產(chǎn)物進行TA克隆及細菌轉(zhuǎn)化,通過藍白篩選活的克隆菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,對含有目的片段的質(zhì)粒進行基因測序,采用VectorNTIversion11和IMGT/V-QUEST對序列進行分析。
　　結(jié)果:1)免疫治療組3年和5年生存率較對照組均顯著升高(87.07％VS74.80%;75.63%VS67.81%,P<0.05)。2)免疫治療組中治療頻次≥3個周期患者5年

7、生存率較<3個周期的患者顯著升高(82.10%VS69.90%,P<0.05)。3)免疫細胞治療前(亦是手術(shù)前荷瘤狀態(tài))外周血TCRCDR3基因譜顯示:3例結(jié)直腸癌患者均表達CD8+TCRVβ2、Vβ3、Vβ5、Vβ8和Vβ22單克隆基因條帶,表明初診時結(jié)直腸癌患者體內(nèi)預存特異性抗腫瘤克隆化T細胞。4)對比分析免疫細胞治療前及治療后的CD8+TCRCDR3基因譜顯示:3例結(jié)直腸癌患者治療前后持續(xù)共表達單克隆Vβ2,而Vβ3、Vβ5、Vβ

8、8和Vβ22則呈現(xiàn)恢復多態(tài)性趨勢,說明結(jié)直腸癌患者本身存在特異性的抗腫瘤克隆化T細胞,免疫細胞治療后預存免疫狀態(tài)得以保持。治療后3例患者均出現(xiàn)了單克隆Vβ11,即免疫細胞治療誘導產(chǎn)生了新的克隆化T細胞。5.免疫治療后結(jié)直腸癌患者外周血中CD8+中央型記憶T細胞比例較治療前顯著升高,即抗腫瘤特異性T細胞比例顯著升高。5)3例結(jié)直腸癌患者外周血TCRVβ2克隆化CDR3區(qū)第1-3位共表達氨基酸序列為CSA,而Vβ11共表達氨基酸序列為CAS