PSMA7對先天性免疫的負調(diào)控作用.pdf

1、先天性免疫系統(tǒng)能快速檢測到病原微生物的入侵依賴于一系列的識別受體,主要有Toll樣受體(TLRs),NOD樣受體(NLRs),RIG-1樣受體(RLRs)。其中,病毒進入細胞內(nèi)誘導(dǎo)的先天性免疫是通過RIG-1樣受體識別病毒RNA的,并啟動定位于線粒體外膜上的蛋白MAVS參與的信號通路,最終導(dǎo)致1型干擾素的產(chǎn)生和一系列抗病毒蛋白的合成。
　　RIG-1位于細胞質(zhì),有C-端RNA螺旋酶結(jié)構(gòu)域和兩個CARD結(jié)構(gòu)域;在外源RNA入侵后,R

2、IG-1正是通過RNA螺旋酶結(jié)構(gòu)域來識別病毒RNA的,從而將自身的CARD結(jié)構(gòu)域暴露并與下游效應(yīng)分子MAVS的CARD結(jié)構(gòu)域結(jié)合。MAVS定位于線粒體外膜,有540個氨基酸殘基,包括N端CARD結(jié)構(gòu)域、脯氨酸富集區(qū)和C端疏水跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)。其中,CARD結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)ζ涔δ艿陌l(fā)揮是必要的。MAVS作為下游效應(yīng)物通過其CARD結(jié)構(gòu)域與RIG-1作用,將RIG-1的信號傳導(dǎo)至下游,通過IKKα/β激酶刺激NF-кB的激活,通過TB

3、K1刺激IFR3的激活;C端疏水跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)AVS錨定在線粒體外膜上,改變MAVS的定位會嚴重損害MAVS誘導(dǎo)1型干擾素表達的能力。MAVS是RIG-1介導(dǎo)的信號通路中唯一能夠與RIG-1結(jié)合的接頭蛋白,MAVS-/-細胞無法應(yīng)答RNA病毒入侵,不能誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生,使細胞抵抗病毒入侵的能力大大降低。在病毒長期的進化過程中,有些病毒把MAVS作為攻擊的靶點,例如丙肝病毒(Hepatitic C virus,HCV)編碼的NS3/4A能夠

4、在MAVS的跨膜結(jié)構(gòu)域切割,使MAVS從線粒體上脫落,通過抑制IFN的產(chǎn)生來逃逸先天性免疫,在甲肝病毒(Hepatitic A virus,HAV)中也存在類似的現(xiàn)象。
　　為了深入研究MAVS在先天性免疫中的作用及其調(diào)控機制,我們利用酵母雙雜交系統(tǒng),以全長的MAVS作為誘餌蛋白,對細胞cDNA文庫進行篩選,獲得了一系列與MAVS相互作用的靶分子。其中篩選到PSMA7分子,PSMA7是蛋白酶體的一個亞基。據(jù)文獻報道,PSMA7能夠

5、與乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)的X蛋白結(jié)合,介導(dǎo)HBX蛋白通過蛋白酶體降解;PSMA7也能夠與HIF1?結(jié)合,募集HIF1?到蛋白酶體降解。因此,PSMA7能夠募集某些蛋白并介導(dǎo)蛋白酶體依賴的目的蛋白的降解。本研究試圖通過研究MAVS與PSMA7的相互作用及生理意義,為先天性免疫的調(diào)控及MAVS在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的作用提供線索。
　　本研究利用免疫沉淀、免疫印跡以及GST-Pull down等方法證明了

6、MAVS與PSMA7二者在細胞內(nèi)存在直接的相互作用。利用構(gòu)建缺失突變體和截短突變體的方法確定了MAVS與PSMA7結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。進一步通過IFN-β、NF-κВ和IRF3的熒光素酶活性實驗發(fā)現(xiàn)PSMA7抑制MAVS激活的IFN-β的轉(zhuǎn)錄,通過poly(I:C)模擬雙鏈RNA病毒和VSV感染實驗發(fā)現(xiàn)PSMA7抑制VSV感染誘發(fā)的先天性免疫。為了研究PSMA7通過MAVS抑制先天性免疫應(yīng)答的分子機制,我們采用Western Bloting方

7、法發(fā)現(xiàn)外源表達的PSMA7導(dǎo)致MAVS的蛋白水平下調(diào)。進一步的研究發(fā)現(xiàn),小RNA干擾內(nèi)源性的PSMA7，IFN-β的mRNA水平和蛋白水平均顯著升高,說明PSMA7通過促進MAVS蛋白的降解抑制了IFN-β的轉(zhuǎn)錄。利用病毒感染和線粒體分離實驗發(fā)現(xiàn),病毒感染的情況下MAVS與PSMA7的相互作用減弱,進一步確定了PSMA7通過MAVS負調(diào)控先天性免疫的生理意義。
　　綜上所述,本研究通過MAVS與PSMA7相互作用研究,闡明了PSM