化學(xué)合成技術(shù)在中藥新藥開發(fā)中的應(yīng)用.pdf

1、目的：中藥是中醫(yī)健康保健、防治疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)和載體，蘊(yùn)含了豐富的科學(xué)內(nèi)涵和極高的實(shí)用價(jià)值。隨著人類醫(yī)療保健事業(yè)的不斷發(fā)展和中醫(yī)藥走向世界的態(tài)勢(shì)日趨明顯，對(duì)中醫(yī)藥資源的社會(huì)需求出現(xiàn)了前所未有的增長，供需矛盾日漸突出。合理開發(fā)和保護(hù)中藥資源，實(shí)現(xiàn)中藥資源的可持續(xù)利用已成為中國政府和中醫(yī)藥行業(yè)的基本共識(shí)。
　　 本研究擬證明化學(xué)合成方法能作為解決中藥資源短缺，保護(hù)中藥藥材資源的有效途徑。蜈蚣三七(曾用名地烏)系毛茛科銀蓮花屬植物林蔭銀

2、蓮花的干燥根莖，在《貴州民間藥物》、《浙江天目山藥植志》等書中均有記載，其性溫，味辛微苦，具有祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨、消腫止痛之功效，善治風(fēng)濕疼痛、跌打損傷。湖北中醫(yī)學(xué)院中藥研究所從蜈蚣三七中的到提取物，制成地烏風(fēng)濕安膠囊，用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，于2004年9月2日獲國家5類中藥新藥的臨床批件，現(xiàn)處于臨床實(shí)驗(yàn)階段。地烏風(fēng)濕安膠囊通過實(shí)驗(yàn)投入生產(chǎn)后，可預(yù)見其原料需求量會(huì)不斷增加。但是蜈蚣三七原植物林蔭銀蓮花生長周期長，其高海拔的生長環(huán)境難以控制

3、，人工栽培較困難。據(jù)調(diào)查原生態(tài)藥材原料產(chǎn)量難以滿足藥品工業(yè)生產(chǎn)化需要，如何保證新藥的順利投產(chǎn)，原料的供應(yīng)是關(guān)鍵。在原生態(tài)原料藥材無法滿足供應(yīng)的態(tài)勢(shì)下，通過化學(xué)合成技術(shù)，合成其藥用活性成分蜈蚣三七有效成分w3，應(yīng)是解決林蔭銀蓮花植物資源匱乏的重要手段之一。前期的實(shí)驗(yàn)研究證明，w3是蜈蚣三七提取物中的主要活性成分，可作為標(biāo)準(zhǔn)品來控制蜈蚣三七藥材、蜈蚣三七提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。而化學(xué)合成的w3與從植物中分離的w3有相似活性，且用化學(xué)合成技術(shù)合成w

4、3具有方法簡便、成本低、耗時(shí)短、不受資源限制、更適合相關(guān)藥品工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)。
　　 方法：
　　 1.合成蜈蚣三七有效成分w3工藝研究利用葡萄糖(C6H1206)、L-鼠李糖(C6H1205)、木糖(C5H1005)、齊墩果酸(C30H4803)等單糖制得化合物1(2，3-二-0-乙?；?4，6-0-芐叉-β--D-葡萄糖乙硫苷)，化合物6(2，3，4，6-四-0-乙?；?β-D-葡萄糖對(duì)甲氧基苯酚氧苷)，化合物4(2

5、，3，4-三-0-苯甲?；?α-L-鼠李吡喃糖三氯乙酰亞胺酯)，化合物11(3，4-二-0-乙?；?1，2-0-原甲酸酯-α-D-吡喃木糖)，化合物17(齊墩果酸三苯基甲基酯)。再以化合物1、4、6、11和17為原料，采用匯聚式路線，完成w3的半合成。
　　 2.合成蜈蚣三七有效成分w3的抗腫瘤作用驗(yàn)證性研究1.藥物分組：本實(shí)驗(yàn)分為6個(gè)組，分別為蜈蚣三七總苷、w3以及齊墩果酸，同時(shí)設(shè)立陽性藥物對(duì)照組(順鉑)、DMSO(二甲基亞砜

6、)組、空白對(duì)照組(未加藥組)。
　　 3.采用噻唑藍(lán)(MTT)還原法測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組對(duì)HepG2細(xì)胞Hel細(xì)胞的生長抑制率。
　　 4.倒置顯微鏡觀察各組藥物作用于HepG2細(xì)胞、Hel細(xì)胞48h后的形態(tài)學(xué)變化。
　　 5.透射電鏡進(jìn)行細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察。
　　 6.流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組藥物作用后HepG2細(xì)胞細(xì)胞周期分布和凋亡率。
　　 7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS15.0分析，用獨(dú)立樣本的t檢

7、驗(yàn)，X2檢驗(yàn)對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，如有差異，多組間參數(shù)兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以a=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。(1)Y軸為細(xì)胞存活率，x軸為藥物濃度，制作細(xì)胞生長曲線。(2)利用公式計(jì)算細(xì)胞48小時(shí)細(xì)胞增殖抑制率。(3)通過EXCEL畫圖法做趨勢(shì)線來求48小時(shí)IC50值。
　　 結(jié)果：
　　 1.合成蜈蚣三七有效成分W3完成蜈蚣三七有效成分w3的合成，純度達(dá)到90％。
　　 2.合成的w3抗腫瘤作用驗(yàn)證性研究
　　

8、2.1不同濃度不同藥物分組的藥物作用于體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞、Hel細(xì)胞48h后，各實(shí)驗(yàn)組生長抑制率結(jié)果如下：
　　 2.1.1HepG2細(xì)胞：W3抑制作用最強(qiáng)(IC50=13.21ug/ml)，蜈蚣三七總苷次之(IC50=31.72ug/ml)，齊墩果酸最弱(IC50=54.21ug/ml)。
　　 2.2.2He l細(xì)胞：w3、蜈蚣三七總苷對(duì)對(duì)Hel細(xì)胞無明顯的細(xì)胞抑制作用。
　　 3.藥物作用后，HepG

9、2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化倒置顯微鏡下觀察到：
　　 空白對(duì)照組：HepG2細(xì)胞貼壁生長，彌散蔓延分布，連接緊密，分布均勻，呈多角形，細(xì)胞透亮，生長狀態(tài)良好。DMSO對(duì)照組：齊墩果酸不溶于水，用DMSO溶解。DMSO作用于HepG2細(xì)胞與空白對(duì)照組比較生長情況無明顯的差異，DSMO沒有細(xì)胞毒性。w3組(28.89ug/ml)：細(xì)胞數(shù)量顯著減少，細(xì)胞相互分離，透亮度差，貼壁大量減少，細(xì)胞體積明顯縮小，變圓，可見大量細(xì)胞崩解碎片，細(xì)胞核縮小

10、或崩解消失，核染色質(zhì)邊聚，可見裸露的核。以中劑量效果最好。蜈蚣三七總苷組(39.64ug/ml)：細(xì)胞相互分離，透亮度差，貼壁大量減少，細(xì)胞數(shù)量減少，體積變小，收縮變圓，可見裸露的核?？梢姶罅考?xì)胞崩解碎片，細(xì)胞核縮小或崩解消失。以高劑量效果較好。齊墩果酸組(14.89ug/ml)：可見細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞有損壞，呈晶狀體分布，細(xì)胞相互分離，透亮度差，貼壁大量減少，體積明顯縮小，收縮變圓。效果略遜于蜈蚣三七總苷。順鉑組對(duì)照組：細(xì)胞數(shù)量減少，

11、細(xì)胞破壞形成碎片，細(xì)胞溶解，可見裸露的細(xì)胞核。
　　 4.電鏡進(jìn)行細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察空白對(duì)照組：可見HepG2細(xì)胞包膜完整，有絨毛，細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器分布均勻，線粒體大小均勻，細(xì)胞核清晰，核膜完整。W3組：細(xì)胞核濃縮，細(xì)胞核擠向一邊，染色質(zhì)深染，聚集成團(tuán)，胞漿濃縮，細(xì)胞質(zhì)萎縮，細(xì)胞器腫脹變形，擁擠，細(xì)胞膜破裂，絨毛消失，線粒體退行性變，腫脹、結(jié)構(gòu)破壞，嵴紊亂、稀疏。蜈蚣三七總苷組：可見細(xì)胞核收縮，核質(zhì)濃縮邊聚。細(xì)胞病變明顯輕于W3組。

12、4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2細(xì)胞的凋亡率。體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞經(jīng)W3藥物高劑量作用后細(xì)胞碎片及早期凋亡細(xì)胞較空白對(duì)照組高。經(jīng)W3藥物中劑量作用后可見大量的細(xì)胞碎片及早期凋亡細(xì)胞，晚期凋亡細(xì)胞或者壞死細(xì)胞也高于空白對(duì)照組。經(jīng)W3藥物低劑量作用后可見大量的細(xì)胞碎片。經(jīng)蜈蚣三七總苷中劑量作用后出現(xiàn)了晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞及早期凋亡細(xì)胞，晚期凋亡細(xì)胞或者壞死細(xì)胞百分率明顯高于空白對(duì)照組，經(jīng)齊墩果酸高劑量作用后可見大量的細(xì)胞碎片。
　　

13、 結(jié)論：
　　 1.本課題所采用的W3半合成路線有效可行。
　　 2.W3對(duì)HepG2細(xì)胞有抑制作用，其作用強(qiáng)于蜈蚣三七總苷、母核齊墩果酸。對(duì)Hel細(xì)胞無明顯的細(xì)胞抑制作用。
　　 3.形態(tài)學(xué)變化(光鏡、電鏡)：w3中劑量的HepG2細(xì)胞毒效果最好，蜈蚣三七總苷次之，母核齊墩果酸再次之。
　　 4.經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果說明W3、蜈蚣三七總苷、母核齊墩果酸其作用機(jī)制可能主要通過殺傷