再上皮化預(yù)防氣管移植后閉塞性氣道疾病的作用研究.pdf

1、研究背景：“再上皮化”是同種異體原位氣管移植所面臨的最大難題之一，目前仍然停留在實(shí)驗(yàn)階段。同種異體原位氣管移植后的再上皮化過程一旦不能完成，則移植氣管將受到免疫排斥因而發(fā)生粘膜下結(jié)締組織增生、淋巴細(xì)胞浸潤、氣管管腔閉塞等一系列的病理改變，即稱為OAD(氣道閉塞性疾病)。關(guān)于上皮組織再生對(duì)于OAD發(fā)生的影響，實(shí)驗(yàn)研究集中采用嚙齒類動(dòng)物的異位氣管移植和原位氣管移植兩種模型得以實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)擬針對(duì)上述兩種模型的建立方法和OAD病理組織學(xué)特征、該

2、模型中受體上皮再生對(duì)于防止OAD的作用、以及在此模型中應(yīng)用細(xì)胞種植的方法實(shí)現(xiàn)上皮再生、維護(hù)上皮完整性、改善和防止OAD發(fā)生等方面進(jìn)行研究。 第一部分代表OAD典型病理結(jié)果的鼠氣管移植模型。 研究目的：建立代表OAD典型病理結(jié)果的鼠異位和原位氣管移植模型。材料和方法：SPF級(jí)BALB/c(供體)和C57BL/6(受體)小鼠共80只，分別設(shè)立實(shí)驗(yàn)組(異系移植)和對(duì)照組(同系移植)，并分別建立原位和異位氣管移植。獲取供體小鼠的

3、長段氣管后，用手術(shù)方法直接種植于同種異系的受體鼠背部皮下，建立異位氣管移植模型。另取供體小鼠的長段氣管，用手術(shù)方法與受體鼠的氣管行端端吻合，建立原位移植模型。結(jié)果：異系小鼠行異位移植四周后，供體氣管段發(fā)生顯著的纖維結(jié)締組織增生、大量淋巴細(xì)胞浸潤、管腔閉塞等，為典型的OAD病理表現(xiàn)。原位氣管移植4周后該移植氣管管腔通暢，纖毛上皮完整，粘膜下組織輕度增生，少量淋巴細(xì)胞浸潤，和異位移植模型構(gòu)成了顯著的病理組織學(xué)對(duì)比。結(jié)論：通過本實(shí)驗(yàn)建立了具有

4、典型OAD病理表現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。原位氣管移植和異位氣管移植的不同病理結(jié)局，說明兩種移植方式后的供體氣管發(fā)生了組織學(xué)上的重新構(gòu)建。 第二部分受體來源的上皮細(xì)胞再生對(duì)于OAD發(fā)生的作用。 研究目的：利用鼠異位和原位氣管移植模型，證明受體來源的上皮細(xì)胞再生是防止OAD發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。材料和方法：SPF級(jí)BALB/c(供體)和C57BL/6(受體)小鼠共80只，分別設(shè)為四組：異位異系、原位異系、異位同系、原位同系組。移植后4周

5、，分別觀察移植氣管段的病理組織學(xué)特征、作定量形態(tài)學(xué)分析(LCR、粘膜下層纖維組織的面積、纖毛上皮的比例)、檢測血CD4+CD8+淋巴細(xì)胞表達(dá)率、并鑒定移植氣管的上皮表型。結(jié)果：①所有供受體同為Balb/c的實(shí)驗(yàn)組，測定的LCR、纖維組織面積和纖毛上皮比例和正常氣管相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)無明顯差異。異位異系小鼠間的氣管移植(Balb/c→B1/6)，由于在4周終點(diǎn)所有移植氣管的管腔均發(fā)生閉塞，只能做纖維組織面積的粗略測定，與正常氣管相比P<0.01

6、，與其它各組相比P<0.05。所有原位異系小鼠的氣管移植，即(Balb/c→B1/6，頸部原位移植)，測得的LCR和正常氣管統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著P<0.05，纖毛上皮比例亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P<0.05。原位同系小鼠間的移植氣管，在LCR、纖維像素面積、纖毛上皮比率等指標(biāo)上，與正常氣管無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。②原位移植的供體Balb/c氣管，具有陽性的B1/6小鼠的上皮抗原性表達(dá)(H2Kd抗原)。③各實(shí)驗(yàn)組的小鼠CD4+/CD8+陽性表達(dá)率的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不明顯

7、。結(jié)論：在原位氣管移植模型中，由于受體上皮細(xì)胞能夠移行和充分覆蓋供體氣管并完成再上皮化，從而能維持供體氣管的管腔通暢。氣管上皮組織的抗原性來源是OAD發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 第三部分上皮細(xì)胞種植對(duì)于防止OAD發(fā)生的作用。 研究目的：探討受體來源的上皮細(xì)胞種植對(duì)于防止供體裸氣管發(fā)生OAD病理結(jié)局的作用。材料和方法：①SPF級(jí)SD大鼠(受體)和Wistar大鼠(供體)各30只；②SD大鼠上皮細(xì)胞行體外培養(yǎng)：③所有移植氣管獲取后，進(jìn)

8、行酶消化上皮細(xì)胞，制成供體裸氣管；④實(shí)驗(yàn)設(shè)為四組，分別取體外培養(yǎng)的SD大鼠上皮細(xì)胞、消化得到的Wistar大鼠上皮細(xì)胞、培養(yǎng)基和0.9％氯化鈉注射液進(jìn)行供體Wistar大鼠裸氣管的管腔內(nèi)灌注，然后行異位氣管移植，將供體氣管種植于受體SD大鼠皮下。移植氣管于移植后4周獲取，行病理組織學(xué)檢查。同時(shí)檢測受體鼠的血CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比率。結(jié)果：上皮細(xì)胞灌注的實(shí)驗(yàn)組氣管，管腔維持通暢完整，粘膜下結(jié)締組織有部分增生，管腔內(nèi)可見到較為完整的

9、纖毛上皮組織。培養(yǎng)基和生理鹽水灌注組的病理組織學(xué)特征相類似，均表現(xiàn)為管腔的閉鎖、上皮組織缺失、顯著的淋巴細(xì)胞浸潤和管腔內(nèi)的纖維結(jié)締組織增生，即典型的OAD特征。受體大鼠的CD4+/CD8+比率，上皮細(xì)胞種植組為1.5±0.3，和生理鹽水灌注的對(duì)照組1.6±0.3無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：上皮組織的抗原性和完整性都是影響同種異體氣管移植中OAD病理結(jié)果的必要因素。外源性上皮細(xì)胞在管腔內(nèi)的存在、并形成具有受體抗原性(SD大鼠)的上皮組織層，有

10、效的防止了OAD的發(fā)生。提示體外培養(yǎng)的上皮細(xì)胞可能通過種植的方式，達(dá)到完全的再上皮化。 第四部分細(xì)胞種植后新生上皮組織的完整性和屏障功能。 研究目的：探討受體來源的上皮細(xì)胞種植于供體氣管管腔后，是否能建立屏障功能并維護(hù)上皮組織的完整性。材料和方法：①SPF級(jí)SD大鼠(受體)和Wistar大鼠(供體)各30只；②SD大鼠上皮細(xì)胞行體外培養(yǎng)；③所有移植氣管獲取后，進(jìn)行酶消化上皮細(xì)胞，制成供體裸氣管；④實(shí)驗(yàn)設(shè)為三組，分別取體外

11、培養(yǎng)的SD大鼠上皮細(xì)胞、培養(yǎng)基、和0.9％氯化鈉注射液進(jìn)行供體Wistar大鼠裸氣管的管腔內(nèi)灌注，然后行異位氣管移植，將供體Wistar大鼠氣管種植于受體SD大鼠皮下。移植氣管于移植后4周獲取，行病理組織學(xué)、上皮組織的超微結(jié)構(gòu)檢查；行移植氣管的CK14、CK18、CFTR和ZO-1免疫組化染色。結(jié)果：①新形成的柱狀上皮細(xì)胞具有明顯的纖毛結(jié)構(gòu)，具有完整的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，含有豐富的線粒體。上皮細(xì)胞間距離窄，且已具備完整的緊密連接。②新生的上皮組

12、織層中，CK14、ZO-1和CFTR呈陽性表達(dá)。結(jié)論：體外培養(yǎng)的上皮細(xì)胞可以通過種植的手段，在異系受體鼠體內(nèi)形成具有較為完整的屏障功能的上皮結(jié)構(gòu)，從而得到保護(hù)供體氣管、維持管腔通暢的病理結(jié)局。 總結(jié)： ①鼠原位和異位氣管移植模型反映了OAD的病理結(jié)果，可作為OAD研究的動(dòng)物模型；②鼠原位和異位氣管移植得到的迥然相異的OAD病理表現(xiàn)，充分提示了氣管上皮組織在OAD發(fā)生發(fā)展中的重要作用；③上皮組織的表型轉(zhuǎn)換(再上皮化，即供體