P311在皮膚創(chuàng)面再上皮化和腎纖維化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、文章主要從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分:P311在皮膚創(chuàng)面再上皮化中的作用及機(jī)制研究
　　目的:創(chuàng)面修復(fù)是一個(gè)動(dòng)態(tài)持續(xù)的過程，需要機(jī)體多種類型細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及一系列細(xì)胞因子和生長因子的共同參與。難愈創(chuàng)面目前已成為一個(gè)重要的臨床難題，其原因除了傳統(tǒng)的燒傷、創(chuàng)傷及外科手術(shù)外，一些慢性疾病如靜脈曲張、糖尿病等也可引起創(chuàng)面難以愈合。難愈創(chuàng)面常?？蓪?dǎo)致終生殘疾，給病人、家庭和社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)社會(huì)負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前患有慢性難愈

2、創(chuàng)面的病人數(shù)量正在全球范圍內(nèi)逐漸增加。鑒于此，深入研究創(chuàng)面愈合的相關(guān)機(jī)制，發(fā)展新的創(chuàng)面治療方法，提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量已成為該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)、重點(diǎn)和難點(diǎn)問題之一。
　　哺乳動(dòng)物皮膚創(chuàng)面愈合一般分為四個(gè)階段:凝血期、炎癥期、新生組織形成和組織重塑。新生組織形成起始于新生表皮遷移覆蓋受損真皮。表皮干細(xì)胞主要分布于毛囊隆突部位，表皮細(xì)胞基底層和皮脂腺組織中，在保持皮膚表皮更新、促進(jìn)創(chuàng)面愈合過程中起著至關(guān)重要的作用。當(dāng)創(chuàng)面形成后，表皮干細(xì)胞活化

3、增殖產(chǎn)生更多短暫擴(kuò)充細(xì)胞，進(jìn)一步增殖、分化遷移至創(chuàng)面發(fā)揮修復(fù)作用。表皮干細(xì)胞目前已成為臨床上治療慢性難愈創(chuàng)面的候選細(xì)胞。
　　P311基因定位于人5號染色體和小鼠18號染色體，首次在小鼠胚胎大腦發(fā)現(xiàn)，并且在成年小鼠小腦、海馬和嗅球中保持較高水平表達(dá)。P311蛋白是一個(gè)分子量為8-kDa的胞內(nèi)蛋白，包含68個(gè)氨基酸，目前不屬于任何已知的蛋白家族。P311蛋白N末端包含PEST結(jié)構(gòu)域（富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸和蘇氨酸），在人、小鼠和

4、雞中高度保守。PEST結(jié)構(gòu)域在目的蛋白通過泛素/蛋白酶體通路降解及蛋白與蛋白之間相互作用和活化過程中發(fā)揮重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn)P311在神經(jīng)和肺泡再生、血壓穩(wěn)態(tài)維持、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤侵襲和肌成纖維細(xì)胞活化等方面發(fā)揮重要作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，P311在早期增生性瘢痕肌成纖維細(xì)胞和創(chuàng)面肉芽組織活化的成纖維細(xì)胞中表達(dá)增高，可以通過促進(jìn)TGF-β1表達(dá)在增生性瘢痕的形成過程中發(fā)揮一定作用。但目前P311在皮膚創(chuàng)面再上皮化過程是否發(fā)揮一定作用尚不

5、清楚。在此基礎(chǔ)上，我們對P311在皮膚創(chuàng)面再上皮化過程中的作用進(jìn)行了研究，主要涉及以下三個(gè)方面:1）P311在皮膚創(chuàng)面新生表皮和正常皮膚表皮中的表達(dá)和分布;2）P311在表皮干細(xì)胞遷移中的作用;3）P311促進(jìn)表皮干細(xì)胞遷移的分子機(jī)制。
　　方法和結(jié)果:
　　1、P311在人和小鼠皮膚創(chuàng)面新生表皮中表達(dá)增高。
　　我們收集了5例人皮膚創(chuàng)面組織標(biāo)本和同體正常皮膚對照，同時(shí)構(gòu)建了小鼠全層皮膚缺損模型，檢測樣本中P311基因

6、表達(dá)。免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)P311主要表達(dá)于人和小鼠皮膚創(chuàng)面新生表皮細(xì)胞胞漿中，而正常皮膚表皮細(xì)胞中無P311表達(dá)。
　　2、P311可以促進(jìn)表皮干細(xì)胞遷移。
　　利用Ⅳ型膠原快速黏附法分離了健康青年男性包皮中表皮干細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光和流式細(xì)胞技術(shù)檢測了分離細(xì)胞中表皮干細(xì)胞分子標(biāo)記物表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光發(fā)現(xiàn)分離細(xì)胞中角蛋白K19和β1整合素高表達(dá)，并且二者于培養(yǎng)細(xì)胞中共定位表達(dá)。流式細(xì)胞技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)細(xì)胞高表達(dá)α6整

7、合素，而陰性標(biāo)志物CD71表達(dá)陰性。我們進(jìn)一步利用細(xì)胞體外創(chuàng)傷模型檢測了P311腺病毒載體轉(zhuǎn)染表皮干細(xì)胞后對細(xì)胞遷移功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)P311增強(qiáng)表達(dá)后可以促進(jìn)表皮干細(xì)胞遷移。
　　我們分離了P311-/-和P311+/+新生小鼠皮膚表皮干細(xì)胞并應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)細(xì)胞高表達(dá)α6整合素，而陰性標(biāo)志物CD71表達(dá)陰性。進(jìn)一步利用細(xì)胞體外創(chuàng)傷模型檢測了P311敲除后對表皮干細(xì)胞遷移功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P311敲

8、除后可以表皮干細(xì)胞遷移明顯下降。
　　小鼠全層皮膚缺損模型可以顯著抑制小鼠皮膚創(chuàng)面收縮，P311+/+小鼠皮膚創(chuàng)面再上皮化速度明顯快于P311-/-小鼠，P311敲除后小鼠皮膚創(chuàng)面再上皮化能力減弱。
　　3、RhoGTPases在P311促進(jìn)表皮干細(xì)胞遷移中的作用研究。
　　P311增強(qiáng)表達(dá)后RhoA、Rac1和Cdc42活性明顯增高，同時(shí)P311敲除后RhoA、Rac1和Cdc42活性下降。我們應(yīng)用細(xì)胞體外創(chuàng)傷模型檢

9、測了RhoA、Rac1和Cdc42特異性抑制劑對P311促進(jìn)表皮干細(xì)胞的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RhoA和Rac1抑制劑可以顯著抑制P311對表皮干細(xì)胞遷移能力的增強(qiáng)作用，而Cdc42抑制劑無明顯影響。
　　結(jié)論：研究首次發(fā)現(xiàn)P311可能通過增強(qiáng)RhoA和Rac1活性促進(jìn)表皮干細(xì)胞遷移和創(chuàng)面再上皮化。本研究拓展了P311在創(chuàng)面愈合中的認(rèn)識，可能為今后創(chuàng)面愈合的研究和治療提供新的線索。
　　第二部分:P311在腎纖維化中的作用及機(jī)制研究

10、
　　目的:腎纖維化是腎臟組織在多種損傷因素的刺激下自我修復(fù)過程失調(diào)的結(jié)果，臨床上，有很大部分比例的腎纖維化病人最終將發(fā)展為腎功能衰竭，需要終生進(jìn)行血液透析或腎臟移植治療維持生命。大量流行病學(xué)研究表明，腎功能衰竭病人的患病率在世界范圍內(nèi)正逐漸增加。腎纖維化疾病現(xiàn)在已發(fā)展成為全球范圍內(nèi)的公共健康問題，給患者個(gè)人、家庭及社會(huì)造成了巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，臨床上針對腎纖維化疾病尚無十分有效的治療方法。鑒于此，深入研究腎纖維化形成的病理

11、機(jī)制，尋找腎纖維化形成的相關(guān)特異性基因是目前該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)、重點(diǎn)和難點(diǎn)問題之一。
　　腎臟纖維化是多種慢性腎臟疾病中不可逆的、進(jìn)行性動(dòng)態(tài)發(fā)展的病理過程，以腎臟小球及小管間質(zhì)中大量的細(xì)胞外基質(zhì)的合成和積聚為主要特征，該過程需要腎臟多種類型細(xì)胞的參與?；|(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活化被認(rèn)為是腎纖維化病理過程中的關(guān)鍵，而基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的來源主要包括成纖維細(xì)胞，腎小管上皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。腎小管上皮細(xì)胞是腎纖維化晚期階段不可逆發(fā)展過程中最

12、主要的效應(yīng)細(xì)胞，在多種促纖維化因子（尤其是TGF-β1）的作用下，腎小管上皮細(xì)胞經(jīng)歷上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程，細(xì)胞表型發(fā)生改變，轉(zhuǎn)分化成為肌成纖維細(xì)胞。TGF-β1是腎小管上皮細(xì)胞EMT過程中關(guān)鍵的調(diào)控分子，可以介導(dǎo)多種慢性腎臟疾病的病理發(fā)展過程，可以誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)波形蛋白(vimentin，一種成纖維細(xì)胞標(biāo)志)和α肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle

13、 actin，α-SMA，一種肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞標(biāo)志）。
　　P311最初在小鼠胚胎大腦中發(fā)現(xiàn)，在成年小鼠小腦、海馬和嗅球中保持較高水平表達(dá)。P311基因定位于人5號染色體、小鼠18號染色體，編碼分子量約8-kDa胞內(nèi)蛋白。P311蛋白包含68個(gè)氨基酸，尚不屬于任何已知蛋白質(zhì)家族。目前研究發(fā)現(xiàn)P311主要在神經(jīng)和肺泡發(fā)育、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲及遷移、血壓穩(wěn)態(tài)維持、肌成纖維細(xì)胞分化和運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，P311基因在早

14、期增生性瘢痕中高表達(dá)，可以通過調(diào)節(jié)TGF-β1和α-SMA表達(dá)促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，在增生性瘢痕形成中發(fā)揮一定的促進(jìn)作用。在此基礎(chǔ)上，我們對P311在腎纖維化中的作用進(jìn)行了研究，主要涉及以下三個(gè)方面:1）P311在腎纖維化組織和正常腎臟組織中的表達(dá)和分布;2）P311敲除后對腎纖維化的影響;3）P311促進(jìn)腎臟纖維化的分子機(jī)制。
　　方法和結(jié)果:
　　1、P311在人和小鼠腎纖維化組織表達(dá)增高。
　　我們收

15、集了22例人腎纖維化組織標(biāo)本和2例人正常腎臟組織標(biāo)本，同時(shí)構(gòu)建了小鼠單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型成功地誘導(dǎo)了小鼠腎臟組織纖維化，檢測樣本中P311基因表達(dá)。HE染色顯示腎纖維化組織可見典型的腎小管擴(kuò)張、萎縮塌陷和大量炎癥細(xì)胞浸潤，Masson染色可見腎臟間質(zhì)大量膠原纖維沉積和積聚。免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)P311主要表達(dá)于人和小鼠腎纖維化組織部分腎小管上皮細(xì)胞胞漿中，而正常腎臟組織中無P311表達(dá)。
　　2、P311可能通過誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)

16、胞EMT促進(jìn)腎臟組織纖維化。
　　α-SMA是組織纖維化過程中肌成纖維細(xì)胞活化的典型標(biāo)志物，因此我們利用免疫組織化學(xué)、Real-Time PCR和western bloting檢測了P311+/+和P311-/-小鼠腎纖維化組織中α-SMA表達(dá)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示α-SMA蛋白主要表達(dá)于腎纖維化組織部分腎小管上皮細(xì)胞胞漿中，并且于P311陽性的細(xì)胞共定位表達(dá)。Real-Time PCR和WesternBloting結(jié)果顯示α-S

17、MA mRNA和蛋白在P311-/-小鼠腎纖維化組織中表達(dá)明顯低于P311+/+小鼠。
　　3、P311敲除后抑制了腎纖維化組織中TGF-β/Smad信號通路。
　　TGF-β/Smad信號在腎纖維化病理發(fā)展過程中其中是否重要的作用，因此我們進(jìn)一步利用Real-Time PCR和western bloting技術(shù)檢測TGF-β1相關(guān)受體和Smad蛋白的表達(dá)。Real-Time PCR結(jié)果顯示與P311+/+小鼠相比，TGF-

18、β1Ⅰ型受體和TGF-β1Ⅱ型受體mRNA表達(dá)水平在P311-/-小鼠腎纖維化組織明顯下降。并且p-Smad2，Smad2，p-Smad3，Smad3，Smad4和Smad7蛋白P311-/-小鼠腎纖維化組織中表達(dá)明顯低于P311+/+小鼠。
　　結(jié)論：研究發(fā)現(xiàn)P311可能通過增強(qiáng)TGF-β/Smad信號通路促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞EMT和腎臟纖維化。本研究拓展了P311在纖維化疾病中的認(rèn)識，可能為今后腎纖維病理過程的研究和治療提供新的