補(bǔ)陽(yáng)還五顆粒有效部位質(zhì)量控制及藥效研究.pdf

1、目的:
　　本研究課題以科學(xué)合理的改進(jìn)優(yōu)化和完善補(bǔ)陽(yáng)還五湯中有效部位的制備工藝，并進(jìn)行以有效部位提取物重新組方的“補(bǔ)陽(yáng)還五顆?！钡乃幮W(xué)實(shí)驗(yàn)研究為主要目標(biāo)，通過(guò)測(cè)定缺血性腦中風(fēng)模型大鼠在給藥前、后腦內(nèi)阿片肽類物質(zhì)，即血漿中強(qiáng)啡呔Al-β樣免疫活性物質(zhì)（ir-DynAl-β），神經(jīng)肽Y(NPY)的水平;血液因子類物質(zhì):β-血栓球蛋白(β-TG)，血小板因子4(PF-4)的水平;血液流變學(xué)指標(biāo)，包括:血沉、纖維蛋白原、紅細(xì)胞壓積、全血

2、粘度、血漿粘度、全血還原粘度、紅細(xì)胞電泳時(shí)間等的變化;觀察大鼠大腦海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，以腦心通膠囊（步長(zhǎng)制藥有限公司）作為陽(yáng)性對(duì)照藥，來(lái)觀察、驗(yàn)證新型補(bǔ)陽(yáng)還五顆粒對(duì)缺血性腦中風(fēng)的療效。
　　同時(shí)采用昆明小鼠做急性毒性實(shí)驗(yàn)，重新再觀察新型補(bǔ)陽(yáng)還五顆粒的安全性，為臨床安全用藥提供科學(xué)的理論依據(jù)。
　　方法:
　?。ㄒ唬┭a(bǔ)陽(yáng)還五湯有效部位提取物的質(zhì)控及其復(fù)方顆粒的制備研究根據(jù)補(bǔ)陽(yáng)還五湯復(fù)方中黃芪、當(dāng)歸尾、川芎、赤芍、

3、桃仁、紅花和地龍，各個(gè)藥物的理化性質(zhì)不同，采用相應(yīng)的提取溶劑和提取、純化方法進(jìn)行處理，選用高效液相色譜法對(duì)君藥有效部位中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮和臣藥有效部位中阿魏酸的質(zhì)量進(jìn)行控制，再按照中醫(yī)藥理論“君、臣、佐、使”的組方原則，以特定的比例組方，制備成“補(bǔ)陽(yáng)還五顆粒”。
　　（二）缺血性中風(fēng)動(dòng)物模型的制備200只健康雄性SPF級(jí)大鼠，體重280～300g，適應(yīng)性飼養(yǎng)兩周，稱量并記錄所有大鼠體重，隨機(jī)抽取8只做空白對(duì)照組，采用改良Pul

4、sinelli四血管閉塞法進(jìn)行手術(shù)處理其余的大鼠，復(fù)制臨床缺血性中風(fēng)動(dòng)物模型。
　?。ㄈ┭a(bǔ)陽(yáng)還五顆粒治療缺血性中風(fēng)的藥效評(píng)價(jià)造模成功存活大鼠隨機(jī)分為4組，缺血性中風(fēng)模型組;缺血性中風(fēng)腦心通治療組（陽(yáng)性對(duì)照組）;缺血性中風(fēng)補(bǔ)陽(yáng)還五顆粒30.4g/kg治療組（高劑量組）;缺血性巾風(fēng)補(bǔ)陽(yáng)還五顆粒15.2g/kg治療組（中劑量組），并設(shè)空白對(duì)照組和假手術(shù)組。灌服藥物后，所有大鼠腹主動(dòng)脈取血，取2.0ml注入枸櫞酸鈉1∶9配比的抗凝管中，

5、混勻分離血漿，用Sysmex CA7000（日本），凝血酶法測(cè)定血漿纖維蛋白原的含量，用競(jìng)爭(zhēng)性抑制法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)技術(shù)測(cè)定血漿中β-血栓球蛋白(β-TG)，血小板因子4(PF-4)的水平;強(qiáng)啡肽(Dyn)、神經(jīng)肽Y(NPY)的含量。另取2.5ml血液注入肝素鈉抗凝管1∶9的配比的抗凝管中，混勻后的全血采用賽科希德SA9000（中國(guó)，北京）全自動(dòng)血液流變學(xué)分析儀測(cè)定全血還原粘度（高切、低切），全血粘度（高切、中切、低切），紅細(xì)胞沉降率、

6、紅細(xì)胞比積等，分離血漿，測(cè)定血漿粘度。其余血液注入2.0％EDTA.Na2抗凝管中，立即混勻，采用sysmex XE-5000（日本）進(jìn)行血常規(guī)分析。抽完血后的大鼠，剪下頭顱，分離大腦，置于固定液中，用于病理分析。
　　（四）急性毒性實(shí)驗(yàn)健康KM小鼠，SPF級(jí)，體重18-22g，雌雄各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，實(shí)驗(yàn)前4-6h禁食不禁水，采用單次口服固定劑量法進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，探明實(shí)驗(yàn)下一步走向，是測(cè)LD50還是MTD。再根據(jù)預(yù)試結(jié)果安排正式實(shí)

7、驗(yàn)，詳細(xì)觀察給藥動(dòng)物的反應(yīng)及死亡情況，并記錄動(dòng)物的外觀、行為活動(dòng)、精神狀況、大小便等情況。連續(xù)觀察14天后，處死小鼠，解剖觀察其心、肝、脾、腎、胸腺、大腦的外觀及顏色并稱取各臟器的重量計(jì)算臟器指數(shù)，并將各個(gè)臟器用10％中性甲醛固定，做病理切片進(jìn)一步觀察。
　　結(jié)果：
　?。ㄒ唬┧幬镉行Р课惶崛∥锏馁|(zhì)控研究黃芪藥材按本實(shí)驗(yàn)的方法，經(jīng)提取、粗分離和純化，測(cè)得黃芪總皂苷粗品和總黃酮類混合物的百分含量為2.83％。經(jīng)高校液相色譜法分

8、析得出，黃芪甲苷的回歸方程:y hat=1.3741x+2.9379，(R2=0.9995，r=0.9997)，總皂苷粗品和總黃酮類混合物中黃芪甲苷的含量高達(dá)6.39％;毛蕊異黃酮的回歸方程:y hat=3476.8x-4375.7，(R2=0.9996，r=0.9998)，總皂苷粗品和總黃酮類混合物中毛蕊異黃酮含量為1.34％。
　?。ǘ┤毖灾酗L(fēng)動(dòng)物模型的建立采用改良Pulsinelli四血管閉塞法永久閉塞大鼠的兩條椎動(dòng)脈及

9、頸總動(dòng)脈后，手術(shù)大鼠眼睛發(fā)暗，甚至變黑，對(duì)外界刺激反應(yīng)變得遲鈍，翻正反射消失;毛發(fā)豎立且失去光澤，精神萎靡，動(dòng)作遲緩，走路打轉(zhuǎn)或轉(zhuǎn)圈，運(yùn)動(dòng)時(shí)軀體向一側(cè)歪斜。同時(shí)伴有體重增長(zhǎng)明顯減緩等癥狀，與缺血性中風(fēng)證候的臨床表現(xiàn)基本接近，表明該模型造模成功。經(jīng)檢測(cè)，血紅蛋白含量、平均RBC血紅蛋白濃度都明顯降低;血小板總數(shù)急劇增高，全血粘度和全血還原粘度，白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞總數(shù)等升高，血漿中神經(jīng)肽類物質(zhì)和血液因子含量也明顯升高，和空白對(duì)照組及假手

10、術(shù)組，進(jìn)行比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。顯微鏡下可見(jiàn)大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的改變。因此，該方法能成功復(fù)制出臨床缺血性中風(fēng)的疾病模型。
　　（三）補(bǔ)陽(yáng)還五顆粒治療缺血性中風(fēng)的藥效評(píng)價(jià)模型大鼠灌服補(bǔ)陽(yáng)還五顆粒后，外觀表現(xiàn)及精神狀態(tài)都有一定程度的改善;異常降低血紅蛋白含量有所改善;異常升高的血小板總數(shù)、血漿纖維蛋白原水平、全血粘度（高切、中切、低切）和全血還原粘度（高切、低切）水平有所恢復(fù)，趨近于正常水平;同時(shí)生化因子

11、神經(jīng)肽Y(NPY)和β-血栓球蛋白(β-TG)、強(qiáng)啡肽(Dyn)和血小板因子4(PF4)的水平也明顯降低。大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)的神經(jīng)元形態(tài)也有一定程度的改善。
　　（四）急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果在預(yù)試驗(yàn)中，補(bǔ)陽(yáng)還五顆粒藥物濃度為2000mg/kg時(shí)，經(jīng)灌胃給小鼠，當(dāng)劑量達(dá)到6g/kg時(shí)，仍不引起動(dòng)物死亡，表明補(bǔ)陽(yáng)還五顆粒無(wú)急性毒性，測(cè)不出LD50，有一個(gè)最大耐受劑量指標(biāo)，測(cè)得昆明小鼠通過(guò)灌胃服藥對(duì)補(bǔ)陽(yáng)還五顆粒的最大耐受量高于6.0g/kg，相

12、當(dāng)于成人日劑量的82倍。給藥組小鼠的肝指數(shù)、心臟指數(shù)、肺指數(shù)、脾指數(shù)、腎指數(shù)與空白對(duì)照組相比較都無(wú)明顯的差異，表明補(bǔ)陽(yáng)還五顆粒無(wú)明顯的靶器官毒害作用，同時(shí)安全范圍較廣。
　　結(jié)論：
　　本課題實(shí)驗(yàn)中采用的改良Pulsinelli四血管閉塞法能夠成功復(fù)制臨床的缺血性中風(fēng)疾病模型，在研的補(bǔ)陽(yáng)還五顆粒能夠改善缺血性中風(fēng)模型大鼠紊亂的血液流變系統(tǒng)，并能降低與中風(fēng)密切相關(guān)的生化因子的水平，還可以促使大腦神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)，從而起到對(duì)缺血性