高血糖加重腦缺血卒中后癲癇發(fā)作分子機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的：明確高血糖對(duì)大鼠腦缺血卒中后癲癇發(fā)作情況，以及對(duì)腦缺血卒中后癲癇大鼠腦組織損傷的影響；探討mTOR信號(hào)通路與高血糖增加腦缺血卒中后癲癇的關(guān)系。
　　材料和方法：健康SD雄性大鼠，體重220-250g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。安靜環(huán)境下飼養(yǎng)，給予充足潔凈的水和攝食。將大鼠隨機(jī)分成5組：假手術(shù)組、空白對(duì)照組、高血糖組、腦缺血組、高血糖﹢腦缺血組，每組10只：①假手術(shù)組：只分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)而不做結(jié)扎；②空白對(duì)照組：不

2、予處理；③高血糖組：通過(guò)腹腔注射STZ建立高血糖模型；④腦缺血組：利用結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈加低血壓（2VO）的方法建立腦缺血模型；⑤高血糖﹢腦缺血組：通過(guò)腹腔注射STZ建立高血糖模型，常規(guī)飼養(yǎng)4周后，利用結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈加2VO的方法建立腦缺血模型。腦缺血后觀察各組大鼠行為變化和監(jiān)測(cè)腦電變化；予腦缺血后24h后分別斷頭取腦，剝離海馬組織，予﹣80℃凍存和灌注取腦進(jìn)行石蠟包埋。通過(guò) TUNEL觀察大腦神經(jīng)元損傷狀況；通過(guò) Wstern-Blo

3、t、PCR和免疫組化檢測(cè)海馬mTOR、p-mTOR表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?s）表示，數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析。先行方差齊性檢驗(yàn)，組間差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以p≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：①模型建立：高血糖組在腹腔注射STZ后，10只大鼠中有9只達(dá)到了實(shí)驗(yàn)要求（血糖濃度>12mmol/l），高血糖﹢腦缺血組大鼠血糖濃度全部達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。常規(guī)飼養(yǎng)4周后，對(duì)高血糖﹢腦缺血組大鼠建立腦

4、缺血模型，其中8只出現(xiàn)癲癇發(fā)作，1只死亡。然后腦缺血組大鼠建立腦缺血模型，其中1只出現(xiàn)癲癇發(fā)作，1只大鼠死亡。
　?、谛袨閷W(xué)表現(xiàn)：高血糖大鼠在腦缺血10h左右出現(xiàn)癲癇大發(fā)作。發(fā)作最初，大鼠表現(xiàn)為胡須抖動(dòng)、面部抽搐、眼睛緊閉、流涎和牙齒節(jié)律性咀嚼，隨后會(huì)出現(xiàn)全身抖動(dòng)、抽搐、站立并向后傾倒，發(fā)作劇烈者，會(huì)表現(xiàn)為在籠中四處逃竄，甚至出現(xiàn)跳躍。
　?、垭娚肀O(jiān)測(cè)：腦缺血組大鼠出現(xiàn)了異常腦電，而高血糖﹢腦缺血組大鼠出現(xiàn)了典型的癲癇波型

5、，腦電中表現(xiàn)有陣發(fā)性的高幅波形，并且具有癲癇波所特有的棘-慢波和多相棘波等波形，同時(shí)頻繁出現(xiàn)多發(fā)棘波。
　?、躎UNEL：假手術(shù)組、空白對(duì)照組、高血糖組、腦缺血組和高血糖﹢腦缺血組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為9.0±0.82、6.0±0.81、19.7±1.24、24.7±1.69、41.3±1.70。高血糖﹢腦缺血組與、高血糖組和腦缺血組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01），腦缺血與假手術(shù)組、空白對(duì)照組、高血糖組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.

6、05），高血糖組與假手術(shù)組、空白對(duì)照組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01），而假手術(shù)組與空白對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p﹥0.05）。結(jié)果表明高血糖不僅能夠造成正常大鼠神經(jīng)元的損傷，而且還能加重腦缺血大鼠海馬神經(jīng)元的損傷。
　　⑤免疫組織化學(xué)：神經(jīng)元胞漿呈棕黃色為陽(yáng)性。p-mTOR在假手術(shù)組、空白對(duì)照組、高血糖組、腦缺血組和高血糖﹢腦缺血組中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為：19.33±1.25、.15.67±1.24、51.33±2.87、44.33

7、±1.69、31.33±1.26。高血糖組、腦缺血組和高血糖﹢腦缺血組與假手術(shù)組和空白對(duì)照組之間 p-mTOR表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p﹤0.01），但高血糖﹢腦缺血組與高血糖組和腦缺血組比較，p-mTOR的表達(dá)有所降低（p﹤0.05）；假手術(shù)組與空白對(duì)照組之間p-mTOR的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p﹥0.05）。提示mTOR信號(hào)通路激活并不是高血糖加重腦缺血卒中后癲癇的原因。
　?、轜estern-Blot：使用分析軟件Gel-Pro

8、 analyzer對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算出各組的相對(duì)灰度值；p-mTOR/mTOR在假手術(shù)組、空白對(duì)照組、高血糖組、腦缺血組和高血糖﹢腦缺血組的比值0.55±0.06、0.41±0.05、1.43±0.09、1.16±0.08、0.93±0.08（p﹤0.01）。
　　結(jié)論：高血糖能加重腦缺血后腦組織的損傷，并極大的提高了癲癇發(fā)生率；p-mTOR在高血糖組、腦缺血組和高血糖﹢腦缺血組中明顯升高，但高血糖﹢腦缺血組低于高血糖組和腦缺血