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文檔簡介
1、目的:構(gòu)建MRP1特異性發(fā)夾狀RNA重組腺病毒載體并研究其對(duì)耐三氧化二砷(ATO)的白血病K562/AS2細(xì)胞MRP1基因表達(dá)的抑制作用。
方法:構(gòu)建MRP1特異性發(fā)夾狀RNA重組腺病毒,并感染K562/AS2細(xì)胞;用熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析MRP1mRNA的表達(dá)水平;流式細(xì)胞儀檢測MRP1蛋白表達(dá);MTT的方法檢測三氧化二砷及依托泊苷的細(xì)胞毒作用。
結(jié)果:
第一部分:將重組質(zhì)粒pGenesil.
2、1-MRP1-shRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,插入入門載體pDONR,并進(jìn)行同源重組,挑選陽性克隆進(jìn)行正向和反向測序。將測序正確的陽性pDONR-MRP1-shRNA穿梭質(zhì)粒和腺病毒骨架質(zhì)粒pAd/BLOCK-iTTM-DEST按說明書進(jìn)行同源重組,并進(jìn)行篩選。將選擇得到的菌株擴(kuò)增培養(yǎng),瓊脂糖電泳DNA回收試劑盒提純質(zhì)粒,得到可以表達(dá)shRNA-MRP1的重組腺病毒質(zhì)粒pAd-shRNA-MRP1。最后進(jìn)行鑒定和滴度測定,感染293A細(xì)胞4-
3、7天后可以觀察到培養(yǎng)瓶里有明顯的綠色熒光蛋白表達(dá),說明有感染能力的重組腺病毒包裝成功。
第二部分:用重組腺病毒pAd-MRP1-shRNA感染K562/AS2細(xì)胞,感染前后K562/AS2中MRP1 mRNA和蛋白表達(dá)水平分別為(34.70±0.28 vs 4.19±0.03,P<0.05)和(26.40±0.16 vs 10.85±0.37,P<0.05)。K562/AS2細(xì)胞對(duì)三氧化二砷及依托泊苷耐藥倍數(shù)分別為(11.
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