ERK1-2信號通路調(diào)控糖尿病視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長因子的作用研究.pdf

1、第一部分:糖尿病大鼠視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激、ERK1/2信號通路激活以及VEGF分泌的研究。
　　目的:研究(1)糖尿病大鼠模型早期視網(wǎng)膜是否出現(xiàn)氧化應(yīng)激;(2)糖尿病大鼠模型早期視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激是否激活了ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;(3)糖尿病視網(wǎng)膜ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活與視網(wǎng)膜VEGF分泌的相關(guān)性;(5)ERK1/2激活在視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞上的表達(dá)。
　　方法:腹腔注射STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型,取不同時(shí)間點(diǎn):7天(d)、

2、14天(d)、21天(d)、1月(m)、2月(m)和3月(m)進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。化學(xué)比色法檢測氧化應(yīng)激損傷相關(guān)指標(biāo),包括超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)濃度、丙二醛(MDA)濃度,電鏡觀察不同類型細(xì)胞(神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、Muller細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、色素上皮細(xì)胞)線粒體的超微結(jié)構(gòu)。Western-blot研究ERK1/2信號通路磷酸化激活的變化趨勢。免疫組織化學(xué)的方法觀察磷酸化激活的ERK1/2在視網(wǎng)膜中表達(dá)的部位。通過

3、EMSA方法研究ERK1/2下游底物AP-1核轉(zhuǎn)錄因子激活的變化趨勢。Real-time PCR以及Western-blot研究VEGFmRNA和蛋白表達(dá)量的變化趨勢。為了觀察氧化應(yīng)激對ERK1/2信號通路的激活作用,給予藥物rocopherol干預(yù)氧化應(yīng)激,Western-blot方法觀察對視網(wǎng)膜ERK1/2磷酸化蛋白表達(dá)影響。
　　結(jié)果:氧化應(yīng)激相關(guān)檢查顯示在糖尿病7d時(shí)視網(wǎng)膜就出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷,表現(xiàn)為SOD活性下降、GSH濃

4、度下降、MDA濃度升高。糖尿病2m時(shí)表現(xiàn)出更顯著的損傷指標(biāo)(P<0.05)。電鏡觀察細(xì)胞線粒體,DM7d,Muller細(xì)胞及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞線粒體出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常。Western-blot結(jié)果,DM7d時(shí)ERK1/2信號通路激活,至2m時(shí)達(dá)到高峰,期間有上下波動(dòng)波動(dòng)。EMSA結(jié)果顯示糖尿病成模后AP-1DNA結(jié)合活性升高,并且波動(dòng)趨勢相似于磷酸化的ERK1/2。VEGF結(jié)果顯示蛋白及mRNA表達(dá)量均升高,波動(dòng)趨勢相似于磷酸化ERK1/2及AP-1

5、。通過干預(yù)氧化應(yīng)激,ERK1/2磷酸化蛋白表達(dá)量下降。免疫組化結(jié)果顯示DM7d視網(wǎng)膜內(nèi)核層出現(xiàn)磷酸化ERK1/2的陽性顆粒,并且在DM2m時(shí)表達(dá)更為增加。
　　討論:(1)在糖尿病模型極早期視網(wǎng)膜出現(xiàn)了氧化應(yīng)激損傷,并且神經(jīng)細(xì)胞的損傷早于血管細(xì)胞。(2)在糖尿病模型極早期視網(wǎng)膜ERK1/2信號通路激活,VEGF蛋白量及mRNA表達(dá)升高,兩者間波動(dòng)趨勢相似。ERK1/2下游核轉(zhuǎn)錄因子AP-1的波動(dòng)也表現(xiàn)出類似趨勢。(3)干預(yù)氧化應(yīng)激

6、能抑制ERK1/2磷酸化激活,提示糖尿病環(huán)境下氧化應(yīng)激可以激活ERK1/2信號通路。(4)視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞可能存在ERK1/2信號通路的激活。
　　第二部分:高糖刺激Muller細(xì)胞對氧化應(yīng)激、ERK1/2信號通路及VEGF的分泌影響研究。
　　目的:研究(1)體外培養(yǎng)的Muller細(xì)胞在高糖環(huán)境下氧化應(yīng)激損傷;(2)高糖環(huán)境下Muller細(xì)胞是否出現(xiàn)ERK1/2信號通路的激活;(3)高糖環(huán)境下Muller細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因

7、子AP-1是否激活;(4)高糖環(huán)境下Muller細(xì)胞VEGF分泌的變化。
　　方法:取新生大鼠視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞純化培養(yǎng)。傳代后2-3代細(xì)胞,高糖(30mM)刺激不同時(shí)間:8h、12h、24h、36h、48h,流式細(xì)胞儀觀察ROS生成,激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體膜電位的下降,電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)。Western-blot方法觀察高糖刺激24h后ERK1/2磷酸化激活的表達(dá)量,細(xì)胞免疫熒光觀察ERK1/2磷酸化激活的表達(dá)。EM

8、SA方法觀察高糖刺激24h后AP-1 DNA探針結(jié)合活性。Real-time PCR檢測AP-1的主要組成元件c-Fos和c-Jun mRNA表達(dá)量。Real-time PCR檢測高糖刺激8h、12h、24h、36h、48hVEGF mRNA表達(dá)量,EIISA檢測高糖刺激8h、12h、24h、36h、48h培液中VEGF濃度。
　　結(jié)果:隨高糖刺激時(shí)間的不斷延長細(xì)胞內(nèi)ROS逐漸升高,在24h驟升(P<0.05)。高糖刺激24h后細(xì)

9、胞線粒體膜電位下降,并且電鏡下線粒體超微結(jié)構(gòu)發(fā)生異常改變。高糖刺激24h后ERK1/2磷酸化蛋白量增加,并且磷酸化ERK1/2表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)。高糖刺激24h后Muller細(xì)胞內(nèi)AP-1 DNA結(jié)合活性升高,Real-time顯示c-Fos和c-Jun mRNA表達(dá)量也升高(P<0.05)。Real-time PCR顯示VEGFmRNA在高糖刺激后升高,并且在24h表現(xiàn)為高峰。ELISA顯示VEGF濃度在高糖刺激后升高,并且在24h表現(xiàn)為

10、高峰(P<0.05)。
　　討論:(1)高糖刺激可致體外培養(yǎng)Muller產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷;(2)高糖刺激24h,Muller細(xì)胞內(nèi)ERK1/2-AP1信號通路激活;(3)高糖刺激后,Muller細(xì)胞分泌VEGF增多,高于正常對照組,而且在24h表現(xiàn)為高峰期。
　　第三部分:分別干預(yù)氧化應(yīng)激及拮抗ERK1/2信號通路對VEGF分泌的作用。
　　目的:研究(1)干預(yù)氧化應(yīng)激對高糖環(huán)境下Muller細(xì)胞內(nèi)ERK1/2信號通路

11、以及VEGF分泌的作用;(2)拮抗ERK1/2信號通路對高糖環(huán)境下Muller細(xì)胞VEGF分泌的作用。
　　方法:(1)高糖30mM刺激Muller細(xì)胞24h,同時(shí)給予抗氧化劑NAC干預(yù)(10mM,5mM),Western-blot研究ERK1/2磷酸化蛋白表達(dá),EMSA研究AP-1 DNA結(jié)合活性,Real-time PCR及ELISA檢測VEGF mRNA含量及蛋白濃度。(2)高糖30mM刺激Muller細(xì)胞同時(shí),給予ERK1

12、/2特異性抑制劑U0126(0.5mM,0.1mM)干預(yù),Western-blot方法研究ERK1/2磷酸化蛋白表達(dá),EMSA方法研究AP-1DNA結(jié)合活性,Real-timePCR及ELISA檢測VEGF mRNA含量及蛋白濃度。
　　結(jié)果:(1)NAC抗氧化干預(yù)后,Western-blot檢測顯示干預(yù)組磷酸化ERK1/2蛋白表達(dá)量較非干預(yù)組下降,并與劑量間存在相關(guān)性(P<0.05)。EMSA檢測顯示NAC干預(yù)組AP-1滯后條帶

13、灰度值低于非干預(yù)組,提示DNA結(jié)合活性下降,并與劑量間存在相關(guān)性(P<0.05)。ELISA檢測顯示NAC干預(yù)組VEGF分泌量較非干預(yù)組下降,并與劑量間存在相關(guān)性(P<0.05)。Real-time PCR檢測顯示NAC干預(yù)組VEGF mRNA較非干預(yù)組下降,并與劑量間存在相關(guān)性(P<0.05)。(2)U0126干預(yù)后Western-blot檢測顯示干預(yù)組磷酸化ERK1/2蛋白表達(dá)量較非干預(yù)組下降,并與劑量間存在相關(guān)性(P<0.05)。

14、EMSA檢測顯示U0126干預(yù)組AP-1滯后條帶灰度值低于非干預(yù)組,提示DNA結(jié)合活性下降,并與劑量間存在相關(guān)性(P<0.05)。ELISA檢測顯示U0126干預(yù)組VEGF分泌量較非干預(yù)組下降,并與劑量間存在相關(guān)性(P<0.05)。Real-time PCR檢測顯示U0126干預(yù)組VEGFmRNA較非干預(yù)組下降,并與劑量間存在相關(guān)性(P<0.05)。
　　討論:抗氧化應(yīng)激可下調(diào)高糖環(huán)境下Muller細(xì)胞ERK1/2信號通路的激活,