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文檔簡介
1、目的:除本底之外,宇宙探索、核能開發(fā)、醫(yī)療照射等活動均使人類有更多的機會暴露于低水平的輻射環(huán)境。低劑量輻射生物學(xué)效應(yīng)一直以來都是放射醫(yī)學(xué)研究的一個熱點。近年來的研究發(fā)現(xiàn)了幾個特殊的低劑量效應(yīng),這些效應(yīng)包括適應(yīng)性反應(yīng)、旁觀者效應(yīng)、基因組不穩(wěn)定性和低劑量超敏感現(xiàn)象等。其中輻射低劑量超敏感現(xiàn)象是指低劑量電離輻射(<0.5Gy)單位劑量的細(xì)胞殺傷比高劑量時更有效,這被稱為“輻射超敏感性”(Hyper-Radiosensitivity,HRS),
2、此后,隨著照射劑量的增加,細(xì)胞對電離輻射的抵抗性逐漸增強,直到1Gy為止,這隨后的效應(yīng)被稱為“誘導(dǎo)的輻射抗性”(Induced Radioresistance,IRR),因此輻射低劑量超敏感現(xiàn)象也稱為HRS/IRR現(xiàn)象。HRS/IRR現(xiàn)象目前主要集中在體外低LET射線的細(xì)胞殺傷效應(yīng)方面的研究,其機制認(rèn)為是與ATM基因有關(guān)。該現(xiàn)象在高LET射線中研究較少。重帶電粒子(重離子)因其不同于其它粒子和射線的物理學(xué)特性,較常規(guī)的C、γ射線和電子束
3、等在腫瘤治療方面有更明顯的優(yōu)越性。目前許多國家都已經(jīng)開始考慮將重離子束(主要為碳離子束)作為今后臨床腫瘤放射治療的一種新手段。在這種治療模式下,受照射的腫瘤部位被置于Bragg 峰處,從而在腫瘤接受較大劑量情況下,其前方正常組織接受較小的劑量。本課題的研究目的為初步探討暴露于低水平碳離子束輻射下的正常細(xì)胞是否存在超敏感的現(xiàn)象,以及這種現(xiàn)象的發(fā)生機制,為今后采用碳離子束治療腫瘤時的方案制定以及相關(guān)防護(hù)提供一定的基礎(chǔ)研究資料。
4、 方法:
第一部分:低水平碳離子束照射人正常細(xì)胞的超敏感現(xiàn)象研究
采用傳統(tǒng)的克隆形成實驗檢測受低水平碳離子束照射后細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù),采取克隆法檢測受照細(xì)胞的hprt基因位點突變頻率。首先采用低水平C射線照射正常人皮膚成纖維細(xì)胞GM0639(GM細(xì)胞,ATM+/+)。在確認(rèn)其存在低劑量超敏感現(xiàn)象的基礎(chǔ)上,選擇0.05~2Gy照射劑量范圍的碳離子束(能量:290 MeV/nucleon,LET:70 keV/μm,
5、劑量率:0.5 Gy/min),觀察GM細(xì)胞在低水平碳離子束照射下的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)和hprt基因位點突變頻率指標(biāo)是否存在HRS/IRR現(xiàn)象。另外還觀察了低水平碳離子束照射下ATM缺陷型的人皮膚成纖維細(xì)胞AT5BIVA(AT細(xì)胞,ATM-/-)各檢測指標(biāo)是否存在超敏感現(xiàn)象,以初步探索低水平碳離子束照射下HRS/IRR現(xiàn)象的作用機制。
第二部分:重離子照射所致超敏感現(xiàn)象ATM相關(guān)機制的探討
首先,選用ATM激活劑,
6、Chloroquine,或者ATM抑制劑,KU55933在碳離子束照射前處理GM細(xì)胞,隨后用低水平碳離子束進(jìn)行照射,觀察受照后細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)和hprt基因位點突變頻率指標(biāo)的HRS/IRR現(xiàn)象是否仍存在。采用Western blotting方法觀察ATM的表達(dá)隨著照射劑量變化的情況,初步確認(rèn)ATM是否可能參與低水平重離子束HRS/IRR現(xiàn)象的發(fā)生機制。
其次,根據(jù)之前相關(guān)機制的報道,結(jié)合ATM蛋白具有調(diào)控細(xì)胞周期以及DNA修
7、復(fù)的兩個最基本功能,通過這兩方面來進(jìn)一步探討ATM是如何在其中發(fā)揮作用的。
細(xì)胞周期調(diào)控:采用免疫熒光染色結(jié)合流式細(xì)胞儀的方法,觀察Histone H3-pS10隨著不同的照射劑量以及不同的照射前預(yù)處理而變化的情況,通過計算有絲分裂指數(shù),反映“早期”G2調(diào)控點的阻滯情況;同時還采用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞周期的分布,反映照射后一定時間G2/M調(diào)控點的阻滯情況。并且還采用Western blotting檢測周期調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)情
8、況。
DNA修復(fù)調(diào)控:首先采用免疫熒光染色的方法,觀察γ-H2AX熒光焦點(foci)的數(shù)目隨不同的照射劑量以及不同的照射前預(yù)處理而變化的情況,反映DNA雙鏈斷裂的修復(fù)效率與HRS/IRR現(xiàn)象發(fā)生的關(guān)系;同時,根據(jù)DNA雙鏈斷裂的兩條修復(fù)路徑,同源重組(HR)和非同源末端聯(lián)接(NHEJ),分別采用Western blotting、免疫熒光染色法觀察兩條路徑的代表性蛋白Rad51和DNA-PKcs的表達(dá)情況和熒光焦點的變化情
9、況,以探討這兩條路徑在HRS/IRR現(xiàn)象發(fā)生中所起的作用。
第三部分:初步探討低水平碳離子束引起的超敏感現(xiàn)象可能的新機制
采用基因芯片技術(shù),篩選碳離子束HRS發(fā)生劑量和IRR發(fā)生劑量在GM細(xì)胞接受照射后不同時間的差異表達(dá)基因,為該現(xiàn)象機制的研究尋找新的、可能的方向。
結(jié)果:
首先,通過低水平X射線照射對存活分?jǐn)?shù)進(jìn)行軟件擬合,同時以ATM基因缺陷的細(xì)胞作為對照,確定了正常人皮膚成纖維
10、細(xì)胞GM0639存在低劑量超敏感現(xiàn)象。進(jìn)而發(fā)現(xiàn),GM細(xì)胞受低水平碳離子束照射后細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)和hprt基因位點突變頻率均存在HRS/IRR現(xiàn)象,HRS出現(xiàn)的劑量分別為0.2Gy和0.17Gy附近,IRR則出現(xiàn)在0.5Gy附近。ATM缺陷的人皮膚成纖維細(xì)胞AT5BIVA受低水平碳離子束照射后則不存在HRS/IRR現(xiàn)象。
低水平碳離子束照射前采用ATM修飾劑預(yù)處理的GM細(xì)胞HRS/IRR現(xiàn)象均消失。其中,ATM抑制劑照前處理可引
11、起IRR的消失,而ATM激活劑的照前處理則導(dǎo)致HRS的消失。同時還發(fā)現(xiàn),ATM的活化水平,即ATM-pS1981的蛋白表達(dá)水平會隨著照射劑量的增加而增加,表現(xiàn)出與HRS/IRR轉(zhuǎn)換的一致性,即0.2Gy照射劑量下,ATM的活化水平較低,會隨著劑量照射而迅速增加,至0.5-0.7Gy以上則增加緩慢。
另外,本課題還發(fā)現(xiàn),ATM依賴的“早期”G2調(diào)控點與低水平碳離子束HRS/IRR現(xiàn)象有關(guān),其機制可能涉及ATM以及ATM下游基
12、因,如Chk2、p53等;低水平碳離子束照射后DNA雙鏈斷裂的修復(fù)效率低,可導(dǎo)致細(xì)胞死亡以及突變效應(yīng)出現(xiàn)HRS現(xiàn)象。NHEJ和HR修復(fù)路徑中的代表性蛋白均在一定程度上依賴于ATM,因此在低水平照射條件下因為ATM沒有被完全活化,也會影響到這兩條路徑正常發(fā)揮作用。
最后,為進(jìn)一步研究機理,通過基因芯片技術(shù)篩選出一些重離子束低劑量照射和高劑量照射后不同時間差異表達(dá)的基因,包括細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、DNA修復(fù)、自噬等基因的改變。<
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