骨質(zhì)疏松并發(fā)動脈粥樣硬化模型的建立及丹參骨寶顆粒防治作用機制的研究.pdf

1、[目的]
　　 建立骨質(zhì)疏松并發(fā)動脈粥樣硬化大鼠模型(V.0.H)；探討V.0.H大鼠骨和動脈的病理變化與血脂變化、BMP-2、MSX-2、PPARγ表達的相互影響關(guān)系；觀察丹參水溶性有效部位群(丹參骨寶顆粒)對V.0.H大鼠的防治作用，探討丹參骨寶顆粒對在體動物抗骨質(zhì)疏松并發(fā)動脈粥樣硬化的作用機制。
　　 [方法]
　　 第一部分骨質(zhì)疏松并發(fā)動脈粥樣硬化大鼠實驗?zāi)Ｐ偷慕?br>　　 實驗一去卵巢(OVX)加

2、高脂和血管壁損傷實驗(V.0.H)：24只6月齡未交配雌性SD大鼠(SPF級，體重264g±10g)隨機分為3組，第一組為假手術(shù)組(Cont)：實驗開始時行假手術(shù)，蒸餾水5ml·kg-1·d-1灌胃：第二組為去卵巢組(OVX)實驗開始時行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，蒸餾水5ml·kg-1·d-1灌胃；第三組為維生素D3+去卵巢+高脂組(V.0.H)：實驗開始時同時行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，以高脂乳劑(5％膽固醇、1％膽酸鈉、0.5％丙基硫氧嘧啶)5 ml·

3、kg-1·d-1灌胃，實驗開始時右下肢肌肉注射維生素D3針劑(3×105U/kg)，每隔4W重復(fù)一次，共3次。共給藥12周。
　　 實驗二單純高脂和血管壁損傷(V.H)及加去卵巢實驗(V.0.H)：32只4月齡未交配雌性SD大鼠(SPF級，體重254g±10g)隨機分為4組，第一組為基礎(chǔ)對照組(BAS)：實驗0天；第二組為假手術(shù)組(Cont)：實驗開始時行假手術(shù)，蒸餾水5 ml·kg-1·d-1灌胃；第三組為維生素D3+高脂組組

4、(V.H)：實驗開始時一次性右下肢肌肉注射6×105U/kg維生素D3針劑；并以高脂乳劑5 ml·kg-1·d-1灌胃；第四組為維生素D3+去卵巢+高脂組(V.0.H)：實驗開始時行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，以高脂乳劑5 ml·kg-1·d-1灌胃，于實驗開始時一次性右下肢肌肉注射維生素D3針劑(6×105U/kg)。共給藥12周。
　　 所有動物實驗結(jié)束前第14d、13d各行頸部皮下注射鈣黃綠素(10mg/kg)，作為第1次熒光標(biāo)記，在

5、實驗結(jié)束前第4d、3d各行頸部皮下注射鈣黃綠素(10mg/kg)作為第2次熒光標(biāo)記，以在骨表面形成綠色雙熒光標(biāo)志，兩次熒光標(biāo)記間隔時間為10d。大鼠心臟取血處死，分離血清作生化指標(biāo)(總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、鈣)測定；取胸主動脈，石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色進行形態(tài)學(xué)分析；分離右脛骨測定骨組織形態(tài)計量學(xué)；分離右股骨作骨密度測定，生物力學(xué)三點彎曲試驗；左尺、股骨作骨成份(骨鈣、磷、以及羥脯氨酸)測定。

6、r>　　 第二部分丹參水溶性有效部位群(丹參骨寶顆粒)對骨質(zhì)疏松并發(fā)動脈粥樣硬化的防治作用機制的研究
　　 48只4月齡未交配雌性SD大鼠(SPF級，體重254g±10g)隨機分為6組，第一組為基礎(chǔ)對照組(BAS)實驗0天；第二組為假手術(shù)組(Cont)：實驗開始時行假手術(shù)，蒸餾水5ml·kg-1·d-1灌胃；其余4組實驗開始時行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，一次性右下肢肌肉注射維生素D3針劑(6×105U/kg)，以高脂乳劑(5％膽固醇、1

7、％膽酸鈉、0.5％丙基硫氧嘧啶)5ml·kg-l·d-1灌胃，分別給予蒸餾水(V.0.H組)、低劑量丹參骨寶顆粒(25mg·kg-1·d-1)混懸液(V.0.H+DSL組)、高劑量丹參骨寶顆粒(50mg·kg-1·d-1)混懸液(V.0.H+DSH組)、辛伐他汀(5mg·kg-1·d-1)混懸液(V.0.H+SIM組)，共給藥8周。丹參骨寶顆粒用量按相當(dāng)于含1∶1的丹參素和丹酚酸B的量。
　　 所有動物實驗結(jié)束前第14d、13d

8、各行頸部皮下注射鈣黃綠素(10mg/kg)，作為第1次熒光標(biāo)記，在實驗結(jié)束前第4d、3d各行頸部皮下注射鈣黃綠素(10mg/kg)作為第2次熒光標(biāo)記，以在骨表面形成綠色雙熒光標(biāo)志，兩次熒光標(biāo)記間隔時間為10d。大鼠心臟取血處死，分離血清作生化指標(biāo)(總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇，鈣、堿性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶)測定；取胸主動脈，石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色進行形態(tài)學(xué)分析；分離右脛骨測定骨組織形態(tài)計量學(xué)；分

9、離右股骨作骨密度測定及生物力學(xué)三點彎曲試驗；左尺骨作骨成份(骨鈣及羥脯氨酸)測定；取左股骨行脫鈣骨免疫組化染色(測定BMP-2、MSX-2及PPARγ的表達量)，HE染色(測定股骨脂肪面積)。
　　 [結(jié)果]
　　 1、高脂喂食加一次性大劑量維生素D(V.H)可使大鼠體重增幅減小，但無統(tǒng)計學(xué)意義；V.H組大鼠血清LDL-C和TC(P<0.01)明顯升高，TG和HDL-C降低(P<0.01)，血鈣有升高趨勢；大鼠動脈全層厚

10、度增厚(P<0.01)，動脈管壁內(nèi)皮的完整性遭破壞，中膜明顯萎縮，粥樣硬化斑塊內(nèi)鈣化明顯。V.H組大鼠的骨組織變化較小，大鼠脛骨上段松質(zhì)骨骨小梁結(jié)構(gòu)連續(xù)，數(shù)量多，分布面積大，且骨小梁較粗大。骨小梁面積百分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)目、尺骨羥脯氨酸含量、股骨近端骨密度、股骨遠(yuǎn)端骨密度、股骨全骨密度、股骨骨礦鹽含量、最大載荷及斷裂載荷均有下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2、去卵巢(OVX)使大鼠體重明顯增長，血清LDL-C和TC明顯

11、升高(P<0.01)，TG略微升高，HDL-C明顯降低(P<0.01)；OVX大鼠動脈形態(tài)學(xué)變化不明顯，動脈管壁有增厚的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義；管腔圓形，內(nèi)膜、中膜和外膜分界清楚，OVX使大鼠脛骨上段松質(zhì)骨骨小梁數(shù)目、骨小梁厚度及面積均明顯減少(P<0.01)，骨小梁間隔增寬，分布松散，骨小梁分離度明顯增加(P<0.01)，骨鈣、骨羥脯氨酸含量均明顯下降(P<0.01)，骨密度明顯降低(P<0.01)，生物力學(xué)參數(shù)：最大載荷、彈性載荷、斷

12、裂載荷均明顯下降(P<0.01)。
　　 3、OVX加上V.H(V.0.H)使大鼠體重增幅減小，與對照組相比，血清LDL-C和TC明顯升高(P<0.01)，而TG和HDL-C降低(P<0.01)，血鈣升高明顯(P<0.01)；動脈管壁厚度明顯增厚(P<0.01)，動脈管壁內(nèi)皮的完整性遭破壞，中膜萎縮，粥樣硬化斑塊內(nèi)鈣化明顯，脛骨上段松質(zhì)骨骨小梁數(shù)目、骨小梁厚度及面積明顯減少(P<0.01)，骨小梁分離度明顯增加(P<0.01)，

13、骨小梁間隔增寬，分布松散，骨小梁熒光減弱，骨羥脯氨酸含量明顯下降(P<0.01)，骨密度明顯降低，最大載荷、彈性載荷、斷裂載荷、剛度系數(shù)明顯下降。V.0.H模型組大鼠BMP-2、MSX-2平均積分光密度顯著低于對照組，分別降低了約94.6％，93.8％(P<0.01)；V.0.H可以導(dǎo)致大鼠骨髓腔中脂肪細(xì)胞數(shù)量明顯增多，PPARγ表達明顯增強，對照組大鼠相比增高了約940.9％(P<0.01)。
　　 4、丹參骨寶顆粒對V.0.

14、H大鼠的防治作用：與模型組相比，丹參骨寶顆粒低劑量(25mg·kg-1·d-1，DSL)和高劑量(50mg·kg-1·d-1，DSH)組的總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇均明顯降低(P<0.01)，而對高密度脂蛋白膽固醇有明顯升高作用(P<0.01)；血清Ca2+含量明顯降低(P<0.01)，大鼠動脈形態(tài)學(xué)顯示，DSL和DSH對粥樣硬化斑塊大小及厚度有減小趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義；鈣化斑面積明顯縮小(P<0.01)；DSL和DSH可使血清堿性磷

15、酸酶和血清抗酒石酸酸性磷酸酶均升高(P<0.01)；DSL使羥脯氨酸含量，骨質(zhì)有機質(zhì)與無機質(zhì)比例明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，DSL和DSH組股骨全、近端、遠(yuǎn)端骨密度及股骨骨礦鹽含量(BMC)均明顯升高(P<0.01)；骨小梁面積百分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)目均顯著增加(P<0.01)，而骨小梁分離度顯著降低(P<0.01)；最大載荷、彈性載荷、斷裂載荷、剛度系數(shù)明顯增高(P<0.01)，DSL和DSH組BMP-2、MSX-2

16、平均積分光密度較模型組明顯增加(P<0.01)，脂肪面積及PPARγ平均積分光密度較模型組明顯減小(P<0.01)，
　　 5、辛伐他汀(5mg·kg-1·d-1)對V.0.H大鼠的預(yù)防作用：與模型組比較，總膽固醇；低密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯均明顯降低(P<0.05)，高密度脂蛋白膽固醇有所增高(P<0.0?)，但未達到對照組水平，改善幅度與丹參骨寶顆粒低劑量相當(dāng)；模型+他汀(5mg·kg-1·d-1)組的鈣化斑面積明顯縮小(

17、P<0.01)；最大載荷，彈性載荷，斷裂載荷，剛度系數(shù)較模型組均有所增加(P<0.05)，但增加幅度沒有丹參低劑量組高。大鼠股骨骨密度，骨礦鹽含量，骨小梁面積、數(shù)量模型+他汀(5mg·kg-1·d-1)組較模型組有增加趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義；BMP-2、MSX-2平均積分光密度較模型組明顯增加(P<0.05)，脂肪面積及PPARγ平均積分光密度較模型組明顯減小(P<0.01)。
　　 [結(jié)論]
　　 1.雌激素減少(OVX

18、)可引起大鼠形成高轉(zhuǎn)換型的骨質(zhì)疏松，但不能導(dǎo)致動脈粥樣硬化的發(fā)生，故單純OVX不能造成大鼠骨質(zhì)疏松并發(fā)動脈粥樣硬化.
　　 2.給予大劑量維生素D3造成血管壁損傷+高脂血癥(V.H)可導(dǎo)致大鼠動脈粥樣硬化的發(fā)生，但不發(fā)生骨質(zhì)疏松，故單純V.H也不能造成大鼠骨質(zhì)疏松并發(fā)動脈粥樣硬化。
　　 3.OVX+V.H(V.0.H)不僅可以導(dǎo)致大鼠動脈粥樣硬化的發(fā)生，同時能發(fā)生大鼠骨質(zhì)疏松，OVX可加重V.H的血脂變化和動脈斑塊鈣化

19、，故V.0.H能造成大鼠骨質(zhì)疏松并發(fā)動脈粥樣硬化；兩次實驗V.0.H均可以導(dǎo)致大鼠骨質(zhì)疏松并發(fā)動脈粥樣硬化，說明V.0.H造成骨質(zhì)疏松并發(fā)動脈粥樣硬化大鼠模型具有可重復(fù)性，可用于相關(guān)實驗的研究。
　　 4.V.0.H引起大鼠血脂嚴(yán)重紊亂，使大鼠粥樣硬化斑塊內(nèi)鈣化明顯，減少大鼠松質(zhì)骨骨小梁面積百分?jǐn)?shù)，骨小梁厚度及骨小梁數(shù)量，增加了骨小梁分離度，降低骨形成率，降低骨密度；下調(diào)股骨BMP-2、MSX-2蛋白的表達，成骨活性降低，同時引

20、起大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞表達PPARγ蛋白顯著增強，骨髓脂肪面積明顯擴大。V.0.H模型可能的機制是由于去勢后消除了雌激素對血管的保護作用，一次性大劑量維生素D3引起鈣代謝紊亂，以及連續(xù)高脂灌胃導(dǎo)致血脂紊亂，三者共同作用從而誘發(fā)動脈粥樣硬化的發(fā)生；同時V.0.H誘導(dǎo)骨髓成脂分化增多、成骨活性明顯減弱，進一步導(dǎo)致成骨小梁骨形成減少，骨量降低；最終導(dǎo)致大鼠骨質(zhì)疏松并發(fā)動脈粥樣硬化。
　　 5.丹參水溶性有效部位群(丹參骨寶顆粒)能有效預(yù)

21、防V.0.H導(dǎo)致大鼠骨質(zhì)疏松并發(fā)動脈粥樣硬化，其作用表現(xiàn)在：改善血脂紊亂，降低血鈣，減小粥樣硬化斑塊內(nèi)鈣化面積，同時能有效減弱骨髓PPARγ蛋白的表達，抑制其成脂，上調(diào)BMP-2、MSX-2在骨組織中的表達，促進成骨分化，提高骨量和骨質(zhì)量。辛伐他汀雖然能改善血脂紊亂，降低血鈣，減小粥樣硬化斑塊內(nèi)鈣化面積，同時能有效減弱骨髓PPARγ蛋白的表達，增加成骨活性，但其增加骨量作用不明顯。結(jié)果提示丹參骨寶顆粒在防治V.0.H導(dǎo)致骨質(zhì)疏松并發(fā)動脈