納豆菌(Bacillus natto T-2)環(huán)脂肽的分離純化及抗腫瘤作用機(jī)制研究.pdf

1、惡性腫瘤是造成人類死亡的第二號(hào)殺手,目前使用的化療藥物存在毒副作用大、耐藥性強(qiáng)等諸多問題。因此從天然產(chǎn)物中尋找高效低毒的抗腫瘤藥物已成為國(guó)內(nèi)外研究的發(fā)展趨勢(shì)。本論文以納豆菌作為研究對(duì)象,圍繞其抗腫瘤活性物質(zhì)的分離純化及其作用機(jī)制進(jìn)行研究。
　　 首先從納豆菌代謝產(chǎn)物中,經(jīng)過酸沉醇提、凝膠層析等手段分離純化出具有明顯抗腫瘤活性的單一組分脂肽(BnCLP),其分子量為1072Da。紅外光譜分析表明該物質(zhì)為環(huán)狀脂肽,氨基酸自動(dòng)分析儀和

2、HPLC-MS/MS分析顯示該環(huán)脂肽的氨基酸序列為L(zhǎng)eu-Len-Val-Asp-Leu-Glu-Leu。
　　 在此基礎(chǔ)上首次對(duì)BnCLP的抗腫瘤活性進(jìn)行了系統(tǒng)研究。噻唑藍(lán)(MTT)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BnCLP對(duì)人白血病K562細(xì)胞和乳腺癌MCF-7細(xì)胞均有較強(qiáng)的抑制作用,但在一定濃度范圍內(nèi),對(duì)來自正常組織的人成纖維HLF細(xì)胞卻無明顯的毒副作用。熒光顯微鏡、透射電鏡、原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL)以及乳酸脫氫酶(LDH)活力測(cè)定結(jié)果

3、,證明BnCLP主要是通過凋亡途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖。
　　 本論文在證明BnCLP對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用具有選擇性的基礎(chǔ)上,探討了BnCLP在K562細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制,目前尚未見相關(guān)報(bào)道。通過流式細(xì)胞儀考察BnCLP作用后細(xì)胞周期的變化,結(jié)果顯示BnCLP通過影響K562細(xì)胞的細(xì)胞周期而誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡,K562細(xì)胞被阻遏于細(xì)胞周期的G1期,且這種G1期積累具有顯著的濃度和時(shí)間依賴性。激光共聚焦顯微鏡測(cè)定鈣離子濃度,發(fā)現(xiàn)Bn

4、CLP誘導(dǎo)的K562細(xì)胞凋亡與[Ca2+]I相關(guān),BnCLP作用后細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]I升高,并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)[Ca2+]I也隨之升高。通過Western-blot方法測(cè)定p21、p27、CylinD1、MAPK、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Cytochrome c等相關(guān)蛋白的變化,同時(shí)還利用Caspase-9、Caspase-3、ERK、JNK、p38抑制劑考察它們對(duì)BnCLP作用的影響。結(jié)果顯示隨著BnCLP濃

5、度增大和作用時(shí)間的延長(zhǎng),p21、p27蛋白的表達(dá)率顯著增加,呈明顯的濃度依賴和時(shí)間依賴效應(yīng),而CylinD1則隨著藥物作用濃度增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量下調(diào),表明p21、p27蛋白的上調(diào)表達(dá)及CylinD1的下調(diào)參與了BnCLP誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的過程,這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果相吻合。采用Western-blot考察MAPK是否參與了BnCLP誘導(dǎo)的凋亡過程,結(jié)果表明BnC:P并未改變JNK和p38蛋白表達(dá),對(duì)磷酸化的JNK和p

6、38表達(dá)也無明顯影響,但卻上調(diào)了ERK蛋白表達(dá),對(duì)磷酸化的ERK表達(dá)也有一定的促進(jìn)作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證p38、JNK和ERK是否參與BnCLP誘導(dǎo)的K562細(xì)胞凋亡過程,測(cè)定了JNK、p38和ERK抑制劑對(duì)BnCLP引起的K562細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明ERK抑制劑可明顯抑制BnCLP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,而JNK、p38抑制劑對(duì)BnCLP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡無顯著影響,這也進(jìn)一步驗(yàn)證了ERK參與了BnCLP誘導(dǎo)的K562細(xì)胞凋亡過程。為揭示[Ca2

7、+]I與ERK之間的關(guān)系,使用鈣離子抑制劑與BnCLP共同作用于K562細(xì)胞。結(jié)果表明鈣離子抑制劑能下調(diào)ERK蛋白的表達(dá),對(duì)磷酸化的ERK表達(dá)也有一定的削弱作用,并抑制BnCLP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在BnCLP誘導(dǎo)K562細(xì)胞的凋亡途徑中,Caspase-3和9被激活,Caspase-3,9抑制劑均可顯著抑制BnCLP引起的凋亡。應(yīng)用Westen-blot法發(fā)現(xiàn)BnCLP可明顯上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá),而且同時(shí)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表

8、達(dá),表明BnCLP誘導(dǎo)的凋亡是由Caspase家族和Bcl-2家族共同調(diào)控的。而Bax過表達(dá)可改變線粒體膜通透性,釋放Cytochrome c,從而激活Caspase-9,再繼續(xù)激活下游的Caspase-3,形成一個(gè)正反饋調(diào)節(jié),從而擴(kuò)大Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)。由此推測(cè)BnCLP的抗腫瘤作用機(jī)制為:納豆菌環(huán)脂肽作用K562細(xì)胞后,首先誘發(fā)[Ca2+]I濃度增加,繼而激活ERK及磷酸化ERK的上調(diào),Caspase家族及Bcl-2家族共同調(diào)控

9、納豆菌環(huán)脂肽誘導(dǎo)的K562細(xì)胞凋亡,Caspase-3處于線粒體中的Bcl-2及Bax上游,Caspase-9則處于Bcl-2和Bax下游,而Bax的過表達(dá)可使Cytochrome c從線粒體釋放,與Apf-1及Caspase-9形成復(fù)合物,活化的Caspase-9進(jìn)一步激活Caspase-3,這樣就完成了一個(gè)正反饋調(diào)控環(huán)。
　　 在體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選用造模劑二甲基苯葸(DMBA)和甲基亞硝基脲(MNU)誘導(dǎo)大鼠乳腺癌,作為B

10、nCLP體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的乳腺癌動(dòng)物模型。通過給藥組和對(duì)照組的比較,測(cè)定BnCLP的體內(nèi)抗腫瘤作用與毒副作用。結(jié)果顯示在抑瘤率與順鉑(DDP)相差不大的情況下,BnCLP對(duì)肝臟、腎臟的毒性明顯低于順鉑,平均體重和生存率也有一定程度的提高。通過對(duì)給藥組和對(duì)照組乳腺癌動(dòng)物模型乳腺組織相關(guān)基因PCNA、ER和p53表達(dá)水平的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)大鼠經(jīng)BnCLP處理后,ER和p53基因表達(dá)水平均有一定程度的提高;PCNA基因表達(dá)水平受到了抑制。
　　 本