黃蓋鵝膏肽類毒素的分離純化及抗腫瘤活性研究.pdf

1、本論文在對(duì)長(zhǎng)白山產(chǎn)黃蓋鵝膏(Amanita subjunquillea.S.lmai)，進(jìn)行野外生長(zhǎng)環(huán)境調(diào)查、子實(shí)體形態(tài)觀察和不同溫度PDA培養(yǎng)基進(jìn)行菌種分離實(shí)驗(yàn)等生物學(xué)特性研究的基礎(chǔ)上，主要對(duì)該菌中的肽類毒素進(jìn)行分離純化，并進(jìn)行了抗腫瘤活性的研究。 生物學(xué)特性研究表明，每年8月到9月發(fā)生子實(shí)體，子實(shí)體黃色，具有菌環(huán)和菌托。子實(shí)體詳細(xì)描述與楊祝良關(guān)于黃蓋鵝膏的描述相同。黃蓋鵝膏菌在PDA培養(yǎng)基不同溫度培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)極其緩慢。

2、 應(yīng)用高效液相色譜法，首次對(duì)黃蓋鵝膏子實(shí)體不同干燥方法的甲醇粗提物進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)對(duì)甲醇粗提物進(jìn)行毒素的分離和純化。分別用A和B兩種洗脫液不同配比進(jìn)行分離。A和B兩種洗脫液。洗脫液A相：10％乙腈+90％0.02M醋酸銨，冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.0；洗脫液B相：30％乙腈+70％0.02M醋酸銨，冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.0。洗脫梯度是：0→15min,B 0→5％，A 100％→95％；15→35min,B 5→80％，A 95％→20％

3、,：35→40min,B 80％，A.20％；40～45minB.80→100％，A 20→0％；45～50minB.100％：50→55min,B 100→0％，A 0→100％并保持10min。研究結(jié)果表明，(1)陰干和冷凍干燥的子實(shí)體的毒素含量相同，干燥方法不影響其毒素含量。 (2)分離純化得到9種化合物，經(jīng)液相色譜、電噴霧質(zhì)譜和核磁共振鑒定6種化合物?；衔?～6分別為：β-鵝膏毒肽、α-鵝膏毒肽、羧基三羥鬼筆毒肽、三羥鬼筆毒肽

4、、羧基二羥鬼筆毒肽和二羥鬼筆毒肽?；衔?和化合物8由于含量少，只測(cè)得分子量都為131，化合物9分子量為587，它們都不是已知的22種肽類毒素。 采用孫氏綜合法，以灌胃和腹腔注射兩種給藥途徑，對(duì)黃蓋鵝膏的甲醇粗提物進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。結(jié)果顯示以灌胃給藥，劑量為600mg/kg，觀察兩周未見死亡，但是右眼均失明。采用腹腔注射給藥，測(cè)得半數(shù)致死量是65.4mg/kg。兩種給藥途徑均發(fā)現(xiàn)粗提物使昆明小鼠的肝臟有脂肪堆積。 應(yīng)用M

5、TT法，檢測(cè)黃蓋鵝膏中分離的羧基三羥鬼筆毒肽和二羥鬼筆毒肽分別對(duì)SGC和SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用。所有數(shù)據(jù)采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，結(jié)果表明羧基三羥鬼筆毒肽和二羥鬼筆毒肽，分別對(duì)SGC和SMMC-7721細(xì)胞增殖無抑制作用。 首次選用H<,22>荷瘤小鼠，對(duì)黃蓋鵝膏甲醇粗提物和二羥鬼筆毒肽進(jìn)行抗腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以腹腔注射給予受試藥。所有數(shù)據(jù)采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，結(jié)果表明鵝膏甲醇粗提物10mg

6、/kg/d和20mg/kg/d具有較明顯的抑制作用，抑瘤率分別為41.30％和43.48％，且具有一定的量效關(guān)系，和對(duì)照組相比無顯著性差異。甲醇粗提物組與5-FU組相比小鼠體重明顯增加。通過對(duì)免疫器官的檢測(cè)，表明甲醇粗提物對(duì)胸腺和脾有明顯增重的作用，說明對(duì)免疫器官有影響。二羥鬼筆毒肽對(duì)H<,22>荷瘤鼠的腫瘤生長(zhǎng)具有較高的抑制作用，且存在量效關(guān)系，不同藥物劑量(0.15mg/kg/d和0.3mg/kg/d)抑瘤率分別為53.03％和65

7、.15％，且具有一定的量效關(guān)系，與對(duì)照組對(duì)比具有顯著性差異(p<0.05)。二羥鬼筆毒肽和5-FU相比體重顯著增加，與對(duì)照組和5-FU對(duì)比，二羥鬼筆毒肽能明顯增加H<,22>荷瘤小鼠胸腺重量，說明對(duì)免役器官有影響。但解剖未發(fā)現(xiàn)器官有明顯變黑現(xiàn)象，說明其對(duì)免疫系統(tǒng)負(fù)面影響較小。 總之，黃蓋鵝膏甲醇粗提物應(yīng)用高效液相分離純化9種單體化合物，鑒定6種分別為β-鵝膏毒肽、α-鵝膏毒肽、羧基三羥鬼筆毒肽、三羥鬼筆毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽和二