KLF4在全反式維甲酸誘導(dǎo)線粒體融合蛋白2表達(dá)中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、已經(jīng)證明，血管活性物質(zhì)及其受體、細(xì)胞因子及其受體和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子所構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞（vascularsmoothmusclecell，VSMC）的功能。近年發(fā)現(xiàn)，全反式維甲酸（all-transretinoicacid，ATRA）及其受體以直接或間接的方式參與VSMC生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)。
　　 Krüppel-likefactor4（KLF4）是一類具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與多種細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化及凋亡

2、的調(diào)節(jié)。
　　 Mfn-2（亦稱為增殖抑制基因，HSG）是一種線粒體融合蛋白，主要在高能量需求的組織，如骨骼肌和心肌中表達(dá)。本研究利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，研究KLF4在ATRA誘導(dǎo)mfn-2表達(dá)中的作用及作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)在VSMC中，KLF4通過直接與mfn.2啟動(dòng)子結(jié)合激活mfn.2表達(dá)，ATRA通過激活JNK和p38MAPK信號(hào)通路使KLF4磷酸化，磷酸化型KLF4與p300結(jié)合并被其乙酰化。KLF4乙酰化后與

3、mfn-2啟動(dòng)子的結(jié)合活性增強(qiáng)。另外，在ATRA處理的VSMC中，RARα與KLF4共同激活mfn-2啟動(dòng)子。
　　 1.KLF4介導(dǎo)ATRA誘導(dǎo)的mfn-2表達(dá)ATRA可同時(shí)上調(diào)KLF4和mfn-2表達(dá)，但KLF4在ATRA誘導(dǎo)mfn-2表達(dá)中的作用尚不清楚。本部分旨在探討KLF4是否介導(dǎo)ATRA誘導(dǎo)的mfn-2表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1.1KLF4介導(dǎo)ATRA對(duì)mfn-2表達(dá)的誘導(dǎo)作用RT-PCR和Western

4、blot結(jié)果顯示，ATRA可顯著誘導(dǎo)KLF4和mfn-2表達(dá)，并具有明顯的時(shí)效關(guān)系。其中，ATRA濃度為10μM和作用時(shí)間為24h時(shí)兩者的表達(dá)變化最明顯。
　　 1.2KLF4直接結(jié)合到mfn-2啟動(dòng)子上并調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄為了明確KLF4是否直接激活mfn-2啟動(dòng)子，用mfn-2報(bào)告基因（pGL3-mfn-2-luc）和KLF4表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染A293細(xì)胞，熒光素酶活性分析結(jié)果顯示，過表達(dá)KLF4以劑量依賴的方式增加mfn-2啟動(dòng)子活性

5、。
　　 1.3KLF4介導(dǎo)ATRA誘導(dǎo)的線粒體成簇和線粒體去極化為了分析mfn-2表達(dá)上調(diào)對(duì)VSMC線粒體動(dòng)力學(xué)的影響，分別用熒光染色和電鏡觀察ATRA處理和KLF4過表達(dá)所引起的線粒體形態(tài)變化。
　　 以上結(jié)果表明，mfn-2是受KLF4調(diào)控的靶基因，在VSMC中，KLF4介導(dǎo)ATRA誘導(dǎo)的mfn-2表達(dá)，提示KLF4在ATRA信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。
　　 2.KLF4對(duì)mfn-2的轉(zhuǎn)錄激活與ATRA誘導(dǎo)K

6、LF4與p300相互作用及KLF4乙?；嚓P(guān)聯(lián)KLF4的轉(zhuǎn)錄活性受與之相互作用的輔助因子以及翻譯后修飾如磷酸化、乙?；榷喾N方式的影響。本部分實(shí)驗(yàn)探討ATRA對(duì)KLF4磷酸化和乙酰化修飾的影響，并研究這些修飾在KLF4調(diào)節(jié)mfn-2表達(dá)中的意義。
　　 2.1ATRA誘導(dǎo)KLF4乙酰化為了闡明ATRA促進(jìn)KLF4激活mfn-2轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制，本部分實(shí)驗(yàn)首先檢測(cè)ATRA對(duì)KLF4乙?；挠绊?。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著VSMC被ATRA刺

7、激時(shí)間的延長(zhǎng)，KLF4乙酰化水平逐漸升高。
　　 2.2ATRA通過激活JNK和p38信號(hào)通路誘導(dǎo)KLF4磷酸化以及KLF4與p300的相互作用為了明確KLF4與p300相互作用是否依賴于KLF4磷酸化，我們檢測(cè)ATRA對(duì)KLF4磷酸化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ATRA刺激VSMC0.5h，KLF4的磷酸化水平開始升高，到1h達(dá)到高峰，并維持在此水平至2h。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，JNK和p38MAPK的磷酸化水平也顯著升高，但ATRA

8、刺激不影響Akt和ERK的磷酸化水平。分別以ERK特異性抑制劑PD98059、Akt特異性抑制劑LY294002、p38MAPK特異性抑制劑SB203580和JNK特異性抑制劑SP600125處理VSMC，阻斷ERK、Akt、p38MAPK或JNK信號(hào)通路的活化后，再以10μMATRA刺激細(xì)胞1h。
　　 Westernblot結(jié)果顯示，SP600125和SB203580預(yù)處理可顯著抑制ATRA誘導(dǎo)的KLF4磷酸化，而PD980

9、59和LY294002對(duì)KLF4磷酸化無明顯影響。VSMC被KLF4磷酸化位點(diǎn)突變體轉(zhuǎn)染后，再以10μMATRA刺激細(xì)胞1h，與對(duì)照組（轉(zhuǎn)染野生型KLF4表達(dá)載體）相比，KLF4磷酸化水平明顯下降，同時(shí)，KLF4與p300的結(jié)合明顯減少。
　　 為了闡明KLF4乙?；欠褚蕾囉谒牧姿峄捌渑cp300的相互作用，用SB203580和SP600125處理VSMC或者用KLF4磷酸化位點(diǎn)突變體轉(zhuǎn)染VSMC后檢測(cè)KLF4的磷酸化水平。

10、結(jié)果顯示，這些抑制劑或KLF4磷酸化位點(diǎn)突變體在抑制KLF4磷酸化的同時(shí)，也使KLF4乙?；斤@著降低。
　　 報(bào)告基因分析結(jié)果顯示，將KLF4磷酸化位點(diǎn)突變體和p300共轉(zhuǎn)染A293后，KLF4激活mfn-2啟動(dòng)子的作用消失。另外，用SP600125和SB203580處理A293細(xì)胞或者用KLF4磷酸化位點(diǎn)突變體轉(zhuǎn)染A293細(xì)胞，在KLF4磷酸化受到抑制后，ATRA喪失對(duì)mfn-2啟動(dòng)子的激活作用。
　　 以上結(jié)果表

11、明，ATRA通過誘導(dǎo)KLF4磷酸化促進(jìn)其與p300相互作用，以及KLF4乙?；?，乙酰化型KLF4對(duì)mfn-2的轉(zhuǎn)錄激活作用增強(qiáng)。
　　 3.RARα通過與KLF4相互作用促進(jìn)KLF4對(duì)mfn-2啟動(dòng)子的激活A(yù)TRA既可通過其受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，也可通過調(diào)節(jié)受體與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的相互作用而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活作用。第二部分實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，KLF4通過JNK和p38MAPK信號(hào)途徑介導(dǎo)ATRA對(duì)mfn-2表達(dá)的誘

12、導(dǎo)作用，本部分實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討維甲酸受體（RAR）在KLF4激活mfn-2表達(dá)中的作用。
　　 3.1ATRA誘導(dǎo)RARα和RARβ的表達(dá)ATRA能否誘導(dǎo)VSMC表達(dá)RAR目前尚不清楚。為了闡明RAR在KLF4介導(dǎo)mfn-2基因表達(dá)中的作用，首先檢查ATRA對(duì)RAR表達(dá)的影響。Westernblot和RT-PCR結(jié)果顯示，ATRA以時(shí)間和劑量依賴的方式顯著誘導(dǎo)RARα表達(dá)，輕微上調(diào)RARβ表達(dá)，對(duì)RARγ的表達(dá)沒有影響。
　

13、　 3.2RARα通過與KLF4結(jié)合參與ATRA誘導(dǎo)KLF4乙?；倪^程因?yàn)樵趍fn-2啟動(dòng)子區(qū)不存在RAR結(jié)合元件，因此，我們推測(cè)，RAR可能通過與KLF4相互作用或通過影響KLF4修飾間接調(diào)節(jié)mfn-2的表達(dá)。我們首先用RARα拮抗劑（Ro41-5253）和RARβ拮抗劑（LE135）處理VSMC或?qū)邢騌AR的小干擾RNA（siRNA）導(dǎo)入VSMC，抑制內(nèi)源性RAR表達(dá)后，進(jìn)一步研究RAR對(duì)KLF4修飾的影響。Westernbl

14、ot結(jié)果顯示，RARα和RARβ拮抗劑不影響ATRA誘導(dǎo)的KLF4磷酸化。用RARα-siRNA敲低RARα表達(dá)顯著抑制KLF4乙?；?，敲低RARβ和RARγ對(duì)KLF4乙?；瘺]有影響。為了闡明RAR促進(jìn)KLF4乙酰化的機(jī)制，我們檢測(cè)KLF4與RAR的相互作用。免疫共沉淀分析結(jié)果證實(shí)，ATRA僅促進(jìn)KLF4與RARα的結(jié)合。
　　 3.3RARα促進(jìn)KLF4對(duì)mfn-2啟動(dòng)子的激活報(bào)告基因分析結(jié)果表明，與單獨(dú)過表達(dá)KLF4相比，共

15、表達(dá)RARα和KLF4顯著增強(qiáng)KLF4對(duì)mfn-2啟動(dòng)子的激活作用，共轉(zhuǎn)染RARα和KLF4表達(dá)載體后，再以ATRA刺激細(xì)胞可使mfn-2啟動(dòng)子活性進(jìn)一步升高。然而，在單獨(dú)過表達(dá)RARα條件下，無論ATRA刺激與否，均不能增強(qiáng)mfn-2啟動(dòng)子活性。
　　 3.4RARα與KLF4相互作用依賴于KLF4磷酸化上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)，KLF4與p300相互作用依賴于KLF4磷酸化。本部分實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢查KLF4磷酸化是否影響其與RARα結(jié)合。免

16、疫共沉淀分析結(jié)果證實(shí)，用SP600125和SB203580處理VSMC或者用KLF4磷酸化位點(diǎn)突變體轉(zhuǎn)染VSMC后，ATRA誘導(dǎo)的RARα與KLF4的相互作用顯著降低。結(jié)果表明，RARα與KLF4相互作用依賴于KLF4的磷酸化。
　　 3.5敲低RARα表達(dá)抑制KLF4與p300結(jié)合為了進(jìn)一步明確RARα促進(jìn)KLF4乙?；姆肿訖C(jī)制，將靶向RARα的小干擾RNA導(dǎo)入VSMC，阻斷ATRA誘導(dǎo)的內(nèi)源性RARα表達(dá)后，檢查RARα對(duì)

17、KLF4與p300相互作用的影響。免疫共沉淀分析結(jié)果顯示，敲低RARα表達(dá)顯著抑制KLF4與p300的結(jié)合。
　　 以上結(jié)果顯示ATRA通過誘導(dǎo)KLF4磷酸化而促進(jìn)KLF4與RARα的結(jié)合，二者的結(jié)合有利于KLF4與p300的相互作用及KLF4被p300乙?；?，乙?；蚄LF4對(duì)mfn-2啟動(dòng)子的激活作用顯著增強(qiáng)。
　　 結(jié)論
　　 1.KLF4介導(dǎo)ATRA誘導(dǎo)的mfn-2表達(dá)是通過與mfn-2啟動(dòng)子區(qū)的KLF4

18、結(jié)合位點(diǎn)相互作用而實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)，KLF4介導(dǎo)ATRA對(duì)核周線粒體成簇及線粒體去極化的誘導(dǎo)作用。
　　 2.ATRA通過激活JNK和p38MAPK信號(hào)途徑而誘導(dǎo)KLF4磷酸化，磷酸化型KLF4與p300相互作用增強(qiáng)并被p300乙酰化。KLF4乙?；茿TRA激活mfn-2啟動(dòng)子的重要條件。
　　 3.ATRA通過誘導(dǎo)KLF4磷酸化而促進(jìn)KLF4與RARα的結(jié)合，二者的結(jié)合有利于KLF4與p300相互作用，進(jìn)而促進(jìn)KLF4乙