膽固醇與Aβ生成關(guān)系的研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是老年人群中最常見的一種神經(jīng)退行性疾病，其主要病理特征是β-淀粉樣蛋白（β-amyloid peptide，Aβ）在神經(jīng)細(xì)胞外的沉積。探究Aβ生成增多的原因?qū)D的預(yù)防和治療有重要意義。
　　 Aβ是β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein， AβPP)經(jīng)β-位點(diǎn)AβPP內(nèi)切酶(beta-site amyloid precursor p

2、rotein cleaving enzyme1，BACE1)作用裂解產(chǎn)生的。研究表明，腦膽固醇或腦細(xì)胞中膽固醇的增加是引發(fā)腦Aβ生成的重要原因。增加神經(jīng)細(xì)胞中的膽固醇能夠使BACE1的活性增高，導(dǎo)致Aβ生成增加，相反，降低細(xì)胞中的膽固醇，Aβ的生成減少。
　　 血膽固醇的改變也能影響腦Aβ的生成。高脂飲食誘導(dǎo)AβPP轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生高膽固醇血癥，可使腦Aβ斑塊樣沉積增加；而給予降膽固醇藥物降低血膽固醇后，Aβ含量減少。已知，膽固醇

3、不能通過正常的血腦屏障，那么，非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的血膽固醇影響腦Aβ生成是否與腦膽固醇有關(guān)呢?
　　 促黃體生成激素(luteinizing Hormone，LH)是下丘腦-垂體-性腺軸中最重要的激素之一。新近發(fā)現(xiàn)，LH在AD患者的血中、腦中的濃度都明顯高于同齡的正常人；用LH處理人神經(jīng)元細(xì)胞后，BACE1活性和Aβ的生成均明顯增加。已知，LH與性腺的LH受體結(jié)合后可調(diào)節(jié)其中的膽固醇合成增加。大腦也存有LH受體，LH是否也可通過調(diào)節(jié)腦

4、細(xì)胞的膽固醇引起Aβ生成增加?目前尚無報(bào)道。
　　 為此，本課題分別用高膽固醇飲食增加Wistar大鼠血膽固醇的水平（第一部分），他汀類藥物降低大鼠血膽固醇水平（第二部分），以及用LH處理神經(jīng)母細(xì)胞瘤M17細(xì)胞（第三部分），導(dǎo)致腦和細(xì)胞中Aβ的生成改變后，觀察此時(shí)腦或細(xì)胞中膽固醇的變化，以分析膽固醇在不同因素引起的Aβ生成中的作用。
　　 第一部分、高膽固醇血癥增加腦Aβ的水平但不改變腦膽固醇含量
　　 目的：用

5、高脂飲食增加Wistar大鼠血膽固醇的水平，導(dǎo)致腦中Aβ的生成改變后，觀察腦膽固醇的變化，探討腦膽固醇在血膽固醇引起Aβ生成中的作用。
　　 方法：成年雄性Wistar大鼠共18只，隨機(jī)分為普通飲食組(NC)和高膽固醇飲食組(HCC，含2％膽固醇、10％豬油)，每組9只，飼養(yǎng)13周。血清用于血膽固醇濃度測(cè)定；大腦組織用于腦膽固醇測(cè)定、總RNA提取和腦Aβ含量測(cè)定。
　　 結(jié)果：
　　 1.高膽固醇飲食增加了血膽固

6、醇濃度
　　 用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清總膽固醇濃度。高膽固醇飲食組大鼠的血膽固醇水平明顯高于普通飲食組(3.15±0.62mmol/l vs1.62±0.10mmol/l，p＜0.001)。表明高膽固醇飲食導(dǎo)致了大鼠的高膽固醇血癥。
　　 2.高血膽固醇水平的增加了腦Aβ水平
　　 用放免法測(cè)定腦Aβ水平。高膽固醇血癥大鼠腦Aβ顯著高于NC組(315.23±73.06pg/mg protein vs266.01±

7、36.41pg/mg protein,p＜0.05)。腦中Aβ的含量與血總膽固醇水平呈顯著正相關(guān)（r=0.89，r2=0.78，p＜0.001）。表明，血總膽固醇的增加使腦Aβ的含量增加。
　　 3.高血膽固醇不影響腦總膽固醇的含量
　　 用膽固醇氧化酶-過氧化物酶法測(cè)定腦總膽固醇含量。高膽固醇血癥大鼠與NC組相比較，腦中的總膽固醇水平的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(5.96±1.26mg/10gvs6.08±0.51mg/10g，

8、p＞0.05)。表明，血膽固醇的增加不影響腦總膽固醇的含量。
　　 4.高血膽固醇不影響腦膽固醇代謝相關(guān)酶基因mRNA的表達(dá)
　　 用RT-PCR法測(cè)定腦膽固醇代謝相關(guān)酶基因mRNA的表達(dá)。高膽固醇血癥大鼠與NC組相比較，腦中膽固醇合成的關(guān)鍵酶HMGCoA還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreductase,HMGR)mRNA(0.58±0.05vs0.54±0.03，p＞0.05)和參

9、與腦膽固醇轉(zhuǎn)化的24S-羥化酶(cholesterol24-hydroxylase,CYP46)mRNA(0.57±0.01vs0.61±0.02,p＞0.05)的表達(dá)水平的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明，血膽固醇的增加不影響腦膽固醇代謝相關(guān)酶基因mRNA的表達(dá)，從而進(jìn)一步證明血膽固醇的增加不影響腦總膽固醇水平。
　　 小結(jié)：
　　 1.腦Aβ的水平隨血膽固醇的增加呈正相關(guān)改變。
　　 2.血膽固醇增高使腦Aβ水平增加是

10、腦膽固醇非依賴性的。
　　 第二部分、血膽固醇的降低減少腦Aβ的水平但不改變腦膽固醇含量
　　 目的：用他汀藥物降低Wistar大鼠血膽固醇的水平，導(dǎo)致腦中Aβ的生成改變后，觀察腦膽固醇的變化，探討腦膽固醇在血膽固醇引起Aβ生成中的作用。
　　 方法：成年雄性Wistar大鼠共20只，隨機(jī)分為對(duì)照組(Con)和氟伐他汀灌胃組(FV)，每組10只，氟伐他汀溶于1％羧甲基纖維素溶液中制成混懸液，按20mg/kg/da

11、y的劑量灌胃，對(duì)照組給予同等劑量1％羧甲基纖維素溶液，連續(xù)灌胃28天。血清用于血膽固醇濃度測(cè)定；大腦組織用于腦膽固醇測(cè)定、總RNA提取、腦Aβ含量測(cè)定和AβPP的免疫組化分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.氟伐他汀降低了血總膽固醇濃度
　　 用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清總膽固醇濃度。氟伐他汀灌胃的大鼠，血膽固醇水平明顯低于正常組大鼠(1.13±0.10mmol/1vs1.53±0.13mmol/l，p＜0.05)。表明氟

12、伐他汀明顯降低了大鼠血膽固醇的水平。
　　 2.血膽固醇的降低減少了腦Aβ
　　 用放免法測(cè)定腦Aβ水平。氟伐他汀處理的大鼠腦Aβ水平明顯低于對(duì)照大鼠組(142.53±27.48pg/mg protein vs213.36±45.21pg/mg protein，p＜0.05)。腦中Aβ的含量與血總膽固醇水平呈顯著正相關(guān)(r=0.54，r2=0.24，p＜0.05)。表明，血總膽固醇的改變可影響腦Aβ的含量。
　　

13、 3.血膽固醇的降低不影響腦總膽固醇的含量
　　 用膽固醇氧化酶-過氧化物酶法測(cè)定腦總膽固醇含量。氟伐他汀處理大鼠與Con組相比較，腦中的總膽固醇水平的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(6.32±0.97 vs6.00±0.58，p＞0.05)。表明，血膽固醇的降低不影響腦總膽固醇的含量。
　　 4.血膽固醇的降低不影響腦膽固醇代謝相關(guān)酶基因mRNA的表達(dá)
　　 用RT-PCR法測(cè)定腦膽固醇代謝相關(guān)酶基因mRNA的表達(dá)。氟伐他汀

14、處理大鼠與Con組相比較，腦中HMGR（0.57±0.05vs0.53±0.05，p＞0.05）和CYP46mRNA（0.88±0.06vs0.99±0.12，p＞0.05）表達(dá)水平的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明，血膽固醇的降低不影響腦膽固醇代謝相關(guān)酶基因mRNA的表達(dá)，從而進(jìn)一步證明血膽固醇的降低不影響腦總膽固醇水平。
　　 5.血膽固醇的降低影響了腦Aβ代謝相關(guān)基因mRNA和蛋白的表達(dá)
　　 用免疫組化法分析腦AβPP的表

15、達(dá)，用RT-PCR法測(cè)定腦Aβ代謝相關(guān)基因蛋白和mRNA的表達(dá)。氟伐他汀處理大鼠，與正常大鼠相比，腦BACE1mRNA的水平（0.15±0.02vs0.30±0.06，p＜0.01），大腦皮質(zhì)和海馬中AβPP的蛋白表達(dá)明顯降低；相反，AβPP裂解途徑中不產(chǎn)生Aβ的酶α-分泌酶(Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein10, ADAM10) mRNA的表達(dá)增加（

16、0.34±0.05vs0.23±0.05，p＜0.01）。表明，血膽固醇降低引起的腦Aβ降低與Aβ生成相關(guān)基因表達(dá)的改變有關(guān)。
　　 小結(jié)：
　　 1.腦Aβ的水平隨血膽固醇濃度的降低呈正相關(guān)改變。
　　 2.血膽固醇降低減少腦Aβ的生成是腦膽固醇非依賴性的。
　　 第三部分、LH增加神經(jīng)細(xì)胞Aβ的生成也增加膽固醇的生成
　　 目的：用LH處理神經(jīng)母細(xì)胞瘤M17細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞中Aβ的生成改變后，觀

17、察細(xì)胞中膽固醇的變化，探討膽固醇在LH引起的Aβ生成中的作用。
　　 方法：用LH處理神經(jīng)母細(xì)胞瘤M17細(xì)胞5天，收集細(xì)胞培養(yǎng)液用于培養(yǎng)液中Aβ含量的測(cè)定；收集細(xì)胞用于Aβ含量、膽固醇含量、以及膽固醇合成、Aβ生成相關(guān)基因的mRNA的測(cè)定。
　　 結(jié)果：
　　 1.LH可使M17細(xì)胞及培養(yǎng)液的Aβ增加
　　 Aβ放免法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同劑量的LH處理細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)基中分泌型的Aβ（0mIU/ml，9.7

18、8±0.22;20mIU/ml，10.48±0.11，p＜0.01；40mIU/ml,11.02±0.20,p＜0.001;80mIU/ml,11.61±0.28,p＜0.001）和細(xì)胞中的Aβ（0mIU/ml，74.02±0.55;20mIU/ml，81.08±3.32，p＜0.01；40mIU/ml，85.89±0.63，p＜0.001;80mIU/ml，99.06±1.29，p＜0.001）含量均明顯增多，且呈劑量依賴性。表明LH

19、能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞中Aβ的生成。
　　 2.LH使細(xì)胞中膽固醇含量增加
　　 神經(jīng)細(xì)胞中膽固醇的測(cè)定結(jié)果顯示，LH使細(xì)胞中膽固醇含量增加，且呈劑量依賴（0mIU/ml，0.29±0.02;20mIU/ml，0.32±0.02，p＜0.05；40mIU/ml，0.35±0.07，p＜0.05;80mIU/ml，0.39±0.06，p＜0.001）；細(xì)胞中膽固醇含量與細(xì)胞及培養(yǎng)液的總Aβ水平呈正相關(guān)。表明，膽固醇有可能在LH促進(jìn)

20、Aβ生成中發(fā)揮作用。
　　 3.LH使細(xì)胞中膽固醇合成關(guān)鍵酶HMGR的mRNA表達(dá)增加
　　 Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，LH處理后，細(xì)胞中HMGRm RNA的表達(dá)增高（0mIU/ml，0.04±0.00;40mIU/ml，0.12±0.01，p＜0.05）。表明LH處理后，細(xì)胞膽固醇含量的增加有可能與HMGR的表達(dá)增加有關(guān)。
　　 4.LH使HMGR的上游調(diào)控因子SREBP2的mRNA表達(dá)增加

21、>　　 Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，LH處理后，SREBP2的mRNA表達(dá)增加（0mIU/ml，0.11±0.01;40mIU/ml，0.38±0.04，p＜0.01）。表明LH處理后，細(xì)胞中HMGR的表達(dá)增加可能與SREBP2的表達(dá)增加有關(guān)。
　　 5.LH影響M17細(xì)胞中Aβ生成相關(guān)基因的表達(dá)
　　 Real-time PCR檢測(cè)的結(jié)果顯示，LH處理后，β-分泌酶裂解途徑中BACE1的mRNA表達(dá)增高(

22、0mIU/ml，0.03±0.00；40mIU/ml，0.04±0.00，p＜0.05)，而AβPP(0mIU/ml,0.10±0.00;40mIU/ml,0.11±0.00,p＞0.05)和α-分泌酶途徑中的ADAM10的mRNA水平?jīng)]有明顯變化(0mIU/ml，0.03±0.00;40mIU/ml，0.02±0.00，p＞0.05)。表明LH處理后，Aβ的生成增多與BACE1的mRNA表達(dá)增加有關(guān)。
　　 小結(jié)：LH可能通過

23、SREBP2-HMGR-膽固醇途徑，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞中膽固醇的合成，從而使細(xì)胞中Aβ生成增加。
　　 結(jié)論：
　　 1.腦Aβ水平可以隨血膽固醇的改變而改變，但這種改變是腦膽固醇非依賴性的。
　　 2.LH使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Aβ增加是膽固醇依賴性的。
　　 3.引起腦Aβ改變的因素不都與腦膽固醇有關(guān)。
　　 神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma， NB)是最常見的小兒顱外實(shí)體性惡性腫瘤，由未分化的交感神

24、經(jīng)細(xì)胞組成，惡性程度高，易復(fù)發(fā)，預(yù)后差。NB對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性是導(dǎo)致患兒預(yù)后不良的主要原因。探究NB耐藥的具體分子機(jī)制對(duì)NB的治療有重要的指導(dǎo)意義。
　　 腫瘤抑制因子p53在抑制腫瘤生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮核心作用。細(xì)胞受到如化療藥物等外界因素刺激時(shí)，p53被活化，轉(zhuǎn)錄與凋亡相關(guān)基因的表達(dá)使細(xì)胞凋亡，達(dá)到抑制腫瘤的目的。p53基因突變或活性喪失都可以使腫瘤細(xì)胞抗凋亡，從而導(dǎo)致細(xì)胞耐藥。
　　 HDM2是p53主

25、要的負(fù)性調(diào)節(jié)分子，通過與p53結(jié)合，促進(jìn)p53的降解或抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性來抑制p53的功能。HDM2過表達(dá)的細(xì)胞，其凋亡力降低，但用nutlin-3抑制該細(xì)胞的HDM2與p53結(jié)合后，細(xì)胞的凋亡能力明顯恢復(fù)。由此推測(cè)，HDM2高表達(dá)并與p53的結(jié)合，很可能是細(xì)胞抗凋亡，導(dǎo)致耐藥的原因。
　　 Noxa是p53的下游基因之一，在廣譜抗腫瘤藥Doxo(Doxorubicin)誘導(dǎo)的NB細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮重要作用。如果上述推測(cè)屬實(shí)，高

26、表達(dá)的HDM2與p53結(jié)合后，是通過促進(jìn)p53降解，還是通過抑制p53/Noxa途徑，使NB細(xì)胞抗凋亡導(dǎo)致耐藥?未見報(bào)道。
　　 為此，本課題分兩部分，以各種NB細(xì)胞株為研究對(duì)象，首先確定了對(duì)Doxo耐藥的NB細(xì)胞株并觀察HDM2和p53在細(xì)胞中的表達(dá)情況，然后，在Doxo-耐藥的NB細(xì)胞中敲低HDM2的表達(dá)，在Doxo-敏感的NB細(xì)胞中過表達(dá)HDM2，觀察HDM2與p53的相互作用，探討了高表達(dá)的HDM2與細(xì)胞抗凋亡，耐藥的關(guān)

27、系，為闡明NB細(xì)胞耐藥的分子機(jī)制及尋找新的NB的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分、HDM2與神經(jīng)母細(xì)胞瘤耐藥的關(guān)系研究
　　 目的：確定對(duì)Doxo耐藥的NB細(xì)胞株，觀察HDM2在耐藥細(xì)胞中的表達(dá)情況，并通過在Doxo-耐藥的NB細(xì)胞中敲低HDM2的表達(dá)，在Doxo-敏感的NB細(xì)胞中過表達(dá)HDM2等手段，觀察細(xì)胞的凋亡情況，探討高表達(dá)的HDM2與細(xì)胞抗凋亡，產(chǎn)生耐藥的關(guān)系；確定Doxo-耐藥細(xì)胞中HDM2與p53的結(jié)

28、合情況；用MG132抑制蛋白酶體降解蛋白的作用，觀察p53是否被降解，探討HDM2是否通過促進(jìn)p53降解，使細(xì)胞抗凋亡而產(chǎn)生耐藥。
　　 方法：分別給予野生型p53的NB細(xì)胞株SK-N-SH，NB-9，NB-19和IMR-32細(xì)胞0.1μg/ml Doxo處理24小時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)，確定Doxo-耐藥的NB細(xì)胞株：用western blot和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)不同NB細(xì)胞中HDM2和p53的表達(dá)；用表達(dá)人全長HDM2的慢病

29、毒感染Doxo-敏感的SK-N-SH細(xì)胞，使HDM2在細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)，用0.1μg/mlDoxo處理24小時(shí)，subG0/G1檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況；用siRNA敲低野生型p53且Doxo-耐藥的IMR32和NB-19細(xì)胞以及p53突變的SK-N-DZ細(xì)胞中HDM2的表達(dá)，0.1μ,g/mlDoxo處理24小時(shí)，DAPI染色后進(jìn)行凋亡形態(tài)分析；對(duì)Doxo-耐藥的IMR32和NB-19細(xì)胞進(jìn)行HDM2與p53的免疫共沉淀；分別給予Doxo-

30、耐藥的NB-19細(xì)胞，Doxo-敏感的SK-N-SH細(xì)胞和HDM2穩(wěn)定過表達(dá)的SK-N-SH(即SK1)細(xì)胞MG132處理24小時(shí)，western blot檢測(cè)細(xì)胞中p53的蛋白量。
　　 結(jié)果：
　　 1.IMR32和NB-19為Doxo-耐藥的NB細(xì)胞株
　　 Doxo處理后，SK-N-SH和NB-9細(xì)胞出現(xiàn)明顯死亡，而IMR32和NB-19細(xì)胞死亡不明顯。表明SK-N-SH和NB-9為Doxo-敏感細(xì)胞株，

31、而IMR32和NB-19為Doxo-耐藥細(xì)胞株。
　　 2.HDM2在Doxo-耐藥NB細(xì)胞中高表達(dá)
　　 Doxo-耐藥的IMR32和NB-19細(xì)胞中，HDM2mRNA和蛋白水平均明顯高于Doxo-敏感的SK-N-SH和NB-9細(xì)胞。表明HDM2在Doxo-耐藥NB細(xì)胞中高表達(dá)。
　　 3.HDM2的過表達(dá)能夠使Doxo-敏感的NB細(xì)胞抗凋亡
　　 過表達(dá)外源性HDM2的Doxo-敏感細(xì)胞（SK1，SK

32、2和SK3細(xì)胞）被Doxo處理后，其凋亡率明顯低于未過表達(dá)HDM2的Doxo-敏感細(xì)胞(SK-N-SH細(xì)胞)。表明，HDM2的過表達(dá)可以使Doxo-敏感的NB細(xì)胞抗凋亡。
　　 4.HDM2的表達(dá)降低能夠使Doxo-耐藥的NB細(xì)胞凋亡
　　 敲低HDM2的Doxo-耐藥細(xì)胞(IMR32和NB-19細(xì)胞)經(jīng)Doxo處理后，其凋亡率明顯高于HDM2未敲低的Doxo-耐藥細(xì)胞(IMR32和NB-19)。表明HDM2的表達(dá)降低可

33、使Doxo-耐藥的NB細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　 5.p53在Doxo-耐藥的NB細(xì)胞中高表達(dá)
　　 在Doxo-耐藥的IMR32和NB-19細(xì)胞中，p53的mRNA和蛋白水平均明顯高于Doxo-敏感的SK-N-SH和NB-9細(xì)胞。表明，HDM2高表達(dá)的Doxo耐藥細(xì)胞，其p53也高表達(dá)。
　　 6.高表達(dá)的HDM2導(dǎo)致細(xì)胞耐藥是p53依賴性的
　　 敲低HDM2的p53野生型Doxo-耐藥細(xì)胞（IMR32和N

34、B-19細(xì)胞）經(jīng)Doxo處理后，其細(xì)胞凋亡率明顯高于未敲低HDM2的Doxo-耐藥細(xì)胞（IMR32和NB-19細(xì)胞）；而p53突變的SK-N-DZ細(xì)胞，其凋亡率并沒有因HDM2的敲低而增加。表明，HDM2表達(dá)降低使Doxo-耐藥的NB細(xì)胞發(fā)生凋亡的過程是p53依賴的。
　　 7.HDM2在Doxo-耐藥NB細(xì)胞中與p53相互結(jié)合
　　 在Doxo-耐藥的IMR32和NB-19細(xì)胞中，用p53的抗體進(jìn)行免疫沉淀時(shí)，在沉淀中

35、檢測(cè)到了HDM2的存在；而用HDM2的抗體進(jìn)行免疫沉淀時(shí)，也能夠在沉淀中檢測(cè)到p53的存在。表明Doxo-耐藥細(xì)胞中的p53確實(shí)是與HDM2相互結(jié)合存在的。
　　 8.Doxo-耐藥的NB細(xì)胞中，p53通過蛋白酶體的降解受到了抑制
　　 在Doxo-耐藥的NB-19細(xì)胞中，給予蛋白酶體的抑制劑MG132處理后，p53的蛋白水平并沒有隨MG132的加入而增加。表明Doxo-耐藥的NB細(xì)胞中，p53并不通過蛋白酶體而降解。<

36、br>　　 9.Doxo-敏感的NB細(xì)胞中，p53可通過蛋白酶體降解
　　 在Doxo-敏感的SK-N-SH細(xì)胞中，給予蛋白酶體的抑制劑MG132處理后，p53的蛋白含量隨MG132劑量的增加而增加。表明，Doxo-敏感的NB細(xì)胞中，p53可通過蛋白酶體而降解。
　　 10.過表達(dá)HDM2能夠抑制Doxo-敏感的NB細(xì)胞p53經(jīng)蛋白酶體的降解。
　　 未轉(zhuǎn)染HDM2的Doxo-敏感細(xì)胞（SK-N-SH細(xì)胞），給

37、予蛋白酶體的抑制劑MG132處理后，p53的蛋白含量隨MG132劑量的增加而增加；而HDM2過表達(dá)后，Doxo-敏感細(xì)胞（SK1細(xì)胞）的p53蛋白含量卻不隨MG132的劑量增加而增加。表明，Doxo-敏感的NB細(xì)胞過表達(dá)HDM2能夠抑制p53經(jīng)蛋白酶體途徑的降解。
　　 小結(jié)：
　　 1.野生型p53的Doxo-耐藥NB細(xì)胞，通過高表達(dá)的HDM2與p53相互作用，繼而抗凋亡，產(chǎn)生耐藥。
　　 2.野生型p53的D

38、oxo-耐藥NB細(xì)胞中，高表達(dá)的HDM2對(duì)p53的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，與蛋白酶體的降解無關(guān)。
　　 第二部分、HDM2的高表達(dá)導(dǎo)致神經(jīng)母細(xì)胞瘤耐藥的分子機(jī)制
　　 目的：探討HDM2抑制p53轉(zhuǎn)錄活性致NB細(xì)胞耐藥的機(jī)制。
　　 方法：用siRNA敲低野生型p53且Doxo-耐藥的IMR32和NB-19細(xì)胞以及p53突變的SK-N-DZ細(xì)胞中HDM2的表達(dá)，0.1μg/ml Doxo處理細(xì)胞24小時(shí)，western b

39、lot和RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中HDM2和Noxa的表達(dá)；用表達(dá)人HDM2全長的慢病毒感染Doxo-敏感的SK-N-SH細(xì)胞，使HDM2在細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)，0.1μg/ml Doxo處理24小時(shí)后，RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中p53下游基因Noxa和p21的表達(dá)，westem blot檢測(cè)細(xì)胞中p53，磷酸化p53，Noxa和p21的表達(dá)，ChIP和雙熒光素酶檢測(cè)p53與Noxa上游p53順式作用元件的結(jié)合能力。
　　 結(jié)果：
　

40、　 1.HDM2的過表達(dá)抑制了Doxo-敏感NB細(xì)胞中p53的活化
　　 Doxo處理后，Doxo-敏感的NB細(xì)胞（SK-N-SH細(xì)胞）中，p53的蛋白量、p53的磷酸化程度、以及p53下游基因p21和Noxa的mRNA和蛋白表達(dá)均被加強(qiáng)；而HDM2過表達(dá)的Doxo-敏感NB細(xì)胞（SK1，SK2和SK3細(xì)胞）中，p53的蛋白量、p53的磷酸化程度，以及p53下游基因p21和Noxa的表達(dá)均沒有明顯變化。表明HDM2的過表達(dá)能夠

41、使Doxo-敏感細(xì)胞中p53的活化受到抑制。
　　 2.HDM2的敲降增加了Doxo-耐藥NB細(xì)胞中Noxa的誘導(dǎo)表達(dá)
　　 Doxo處理后，與未敲低HDM2的Doxo-耐藥NB細(xì)胞（IMR32和NB-19細(xì)胞）相比，HDM2敲低細(xì)胞中，p53下游基因Noxa的mRNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯增加。表明HDM2的敲降使Doxo-耐藥NB細(xì)胞中Noxa的表達(dá)增加。
　　 3.HDM2的過表達(dá)抑制了Doxo-敏感NB細(xì)

42、胞Noxa的誘導(dǎo)表達(dá)
　　 Doxo處理后，Doxo-敏感細(xì)胞（SK-N-SH細(xì)胞）中，Noxa mRNA的表達(dá)增加，而過表達(dá)HDM2的Doxo-敏感細(xì)胞（SK1細(xì)胞）中，Noxa的mRNA表達(dá)沒有改變。表明HDM2的過表達(dá)能夠抑制Noxa的誘導(dǎo)表達(dá)。
　　 4.在Doxo-耐藥的NB細(xì)胞中，p53轉(zhuǎn)錄活性被HDM2所抑制
　　 Doxo處理后，與未敲低HDM2的p53野生型Doxo-耐藥NB細(xì)胞（IMR32和N

43、B-19細(xì)胞）相比，HDM2敲低細(xì)胞中，其p53下游基因Noxa的mRNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯增加；而在p53突變的NB細(xì)胞SK-N-DZ中，HDM2敲低后，Noxa的蛋白表達(dá)沒有增加。表明，Doxo耐藥細(xì)胞中的p53轉(zhuǎn)錄活性被HDM2所抑制。
　　 5.HDM2的過表達(dá)抑制了Doxo-敏感NB細(xì)胞中p53與Noxa上游p53順式作用元件的結(jié)合
　　 Doxo處理后，Doxo-敏感NB細(xì)胞（SK-N-SH細(xì)胞）的p53

44、能夠與Noxa上游的p53順式作用元件結(jié)合；而HDM2過表達(dá)的Doxo-敏感細(xì)胞（SK1細(xì)胞）中，p53與其順式作用元件的結(jié)合受到了抑制。表明HDM2的過表達(dá)能夠抑制Doxo-敏感的NB細(xì)胞中p53與Noxa上游p53順式作用元件的結(jié)合。
　　 小結(jié)：高表達(dá)的HDM2通過與p53結(jié)合，抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性，下調(diào)其下游的凋亡基因表達(dá)，導(dǎo)致p53野生型NB細(xì)胞抗凋亡，產(chǎn)生耐藥性。
　　 結(jié)論：高表達(dá)的HDM2通過抑制p53的