1,25-二羥維生素D3改善血管內(nèi)皮胰島素抵抗的作用研究.pdf

1、目的：
　　觀察1，25(OH)2D3對(duì)軟脂酸(PA)誘導(dǎo)胰島素抵抗(IR)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs) NO產(chǎn)生及胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路Akt/eNOS的影響，明確1，25(OH)2D3對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，探討1，25(OH)2D3改善內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1、含不同濃度PA(0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9 mmol/L)的DMEM培養(yǎng)基與HUVECs共同培養(yǎng)1

2、8h，并設(shè)置正常對(duì)照組，觀察各組細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)，CCK8法測(cè)定各組細(xì)胞活性;不同濃度PA預(yù)孵育HUVECs18h后，加入含胰島素（終濃度為1×10-9mol/L）的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集培養(yǎng)液和提取細(xì)胞蛋白。采用葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化物酶法(GOD-POD)檢測(cè)培養(yǎng)液中葡萄糖濃度，鑒定胰島素抵抗內(nèi)皮細(xì)胞模型。
　　2、0.6mM PA誘導(dǎo)正常HUVECs18h后，不同濃度的1，25(OH)2D3(0，0.01

3、，0.1，1，10，100nM)干預(yù)胰島素抵抗內(nèi)皮細(xì)胞1h，提取各組細(xì)胞蛋白檢測(cè)peNOS(Ser1177)，pAkt(S473)的相對(duì)表達(dá)量;0.6mM PA誘導(dǎo)HUVECs18h后，建立胰島素抵抗內(nèi)皮細(xì)胞模型，設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組，用1nM1，25(OH)2D3干預(yù)HUVECs不同時(shí)間（分別為15，30，60，120，240，480s），取細(xì)胞上清液用硝酸鹽/亞硝酸鹽熒光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)NO分泌量。
　　3、0.6mM PA誘導(dǎo)H

4、UVECs18h后，建立IR內(nèi)皮細(xì)胞模型，設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組，用1nM1，25(OH)2D3繼續(xù)干預(yù)胰島素抵抗內(nèi)皮細(xì)胞不同時(shí)間(0.5h，1h，2h，4h，8h，16h)，Trizol法提取細(xì)胞mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，熒光定量PCR法檢測(cè)基因ET-1 mRNA和VDRmRNA的水平。
　　4、0.6mM PA誘導(dǎo)HUVECs18h后，建立IR內(nèi)皮細(xì)胞模型，設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組，用1nM1，25(OH)2D3繼續(xù)干預(yù)胰島素抵抗內(nèi)

5、皮細(xì)胞1h，細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)VDR在各組細(xì)胞的表達(dá)及分布。
　　結(jié)果：
　　1.正常HUVECs為橢圓形或梭形，呈鵝卵石鋪路樣，生長(zhǎng)迅速。PA干預(yù)后HUVECs形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞折光度低，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，生長(zhǎng)緩慢，貼壁細(xì)胞減少。不同濃度的PA培養(yǎng)HUVECs18h后，在PA濃度為0.4-0.8mM時(shí)，細(xì)胞增殖活力逐漸下降，各組與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p均＜0.01）。與正常對(duì)照組相比，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)PA孵育后，當(dāng)

6、PA濃度為0.3-0.8mM時(shí)PA干預(yù)組細(xì)胞外葡萄糖消耗顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p均＜0.01）。PA干預(yù)HUVECs18h，濃度為0.6mM時(shí)，葡萄糖消耗量最少(0.4210±0.0134 mmol/mg vs1.0923±0.1693 mmol/mg，p＜0.01)，該狀態(tài)所對(duì)應(yīng)的藥物濃度即為造成胰島素抵抗細(xì)胞模型的最佳濃度。
　　2.Western Blot結(jié)果顯示:不同濃度的125(OH)2D3(0.01，0.1，1，

7、10，100nM)干預(yù)胰島素抵抗內(nèi)皮細(xì)胞1h后peNOS，pAkt表達(dá)量增加，在1nM時(shí)表達(dá)量最高，與PA干預(yù)組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.1173±0.0225 vs0.0682±0.0040，0.9260±0.2770 vs0.4432±0.0046,p＜0.05)。
　　3.NO檢測(cè)結(jié)果:與正常組比較，PA干預(yù)組HUVECs NO產(chǎn)量明顯減少(0.5065±0.0301μM vs0.7102±0.0438μM，p＜0.01)。與P

8、A干預(yù)組比較，VD+PA干預(yù)組HUVECs NO產(chǎn)生增加，其中在30s和60s時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p均＜0.01）。
　　4.熒光定量PCR結(jié)果顯示:0.6mM PA干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞后，ET-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯升高，差異有顯著性意義(4.52E-04±1.13E-04 vs3.18E-05±9.47E-06，p＜0.05)。與PA干預(yù)組比較，VD+PA干預(yù)組ET-1 mRNA的水平明顯降低，在0.5h，1h，2h，

9、4h，8h，16h均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p均＜0.05）。VDR mRNA的水平各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　5.細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示:VDR在各組細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)都有表達(dá);與正常組比較，PA干預(yù)組VDR表達(dá)呈減弱的趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(平均光密度值1.428±0.027 vs1.632±0.112，p＞0.05); VD+PA組與PA干預(yù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（平均光密度值1.428±0.027 vs1.434±0.1