農(nóng)產(chǎn)品中兩種真菌毒素蛋白質(zhì)芯片檢測技術(shù)的研究.pdf

1、真菌毒素是一類由不同真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛污染各種農(nóng)產(chǎn)品和飼料，它不僅降低產(chǎn)品質(zhì)量，帶來嚴(yán)重的食源性中毒問題，而且可以引起人和動(dòng)物的急慢性中毒，如免疫抑制、組織壞死、肝腎損傷、繁殖障礙、致癌致畸等病理變化，從而影響人和動(dòng)物的身體健康，在全球食品安全中受到高度關(guān)注。近年來，真菌毒素的檢測技術(shù)得到了不斷發(fā)展，常見的有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。色譜分析法雖然檢測靈敏度高，可是樣品前處

2、理繁瑣、操作復(fù)雜，在實(shí)際應(yīng)用中較難普及；而ELISA方法具有敏感、特異、穩(wěn)定、簡便的優(yōu)點(diǎn)，非常適合真菌毒素的檢測，但每次只能檢測一種真菌毒素。由于現(xiàn)實(shí)中農(nóng)產(chǎn)品往往不是受一種真菌毒素污染，而是同時(shí)受多種真菌毒素污染，因此，具有微型化、高通量優(yōu)點(diǎn)的蛋白質(zhì)芯片技術(shù)成為多種真菌毒素同時(shí)快速檢測的發(fā)展趨勢。本試驗(yàn)針對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中常見的、危害性較大的赭曲霉毒素A(OTA)與伏馬菌素B1(FB1)為研究對(duì)象，通過完全抗原的制備，以單克隆抗體技術(shù)為支撐，采

3、用間接競爭的檢測原理，以熒光作為檢測信號(hào)，對(duì)真菌毒素多元檢測的蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行了探索。
　　 試驗(yàn)Ⅰ赭曲霉毒素A完全抗原的制備與檢測
　　 為了制備蛋白質(zhì)芯片用探針，本試驗(yàn)采用活性酯法對(duì)OTA與卵清蛋白(OVA)進(jìn)行偶聯(lián)。取2 mg OTA溶解于0.5 mL無水四氫呋喃(THF)中，再分別加入2 mgN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、3 mg N，N-二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)，于室溫下振蕩反應(yīng)24 h進(jìn)行活化，離心，取上清

4、，棄沉淀；將上清液真空干燥，其活化產(chǎn)物殘留物溶于0.5 mL二甲基甲酰胺(DMF)中。將上述溶液緩慢滴加于載體蛋白OVA溶液中，振蘇反應(yīng)4 h，于PBS溶液中4℃透析72 h。透析液經(jīng)PEG20000濃縮后，進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定。對(duì)于偶聯(lián)后的完全抗原分別進(jìn)行紫外掃描、質(zhì)譜分析和蛋白質(zhì)芯片檢測。紫外掃描顯示，偶聯(lián)物與OTA和OVA的渡型不同，發(fā)生了明顯的位移，可初步判斷偶聯(lián)成功。根據(jù)紫外掃描可分析OTA與OVA的連接比，在280 nm和37

5、9 nm的波長下，所測A值分別為0.389和0.875，得出OTA與OVA的連接比為10:1；根據(jù)質(zhì)譜分析偶聯(lián)物的分子量為50350.141，可計(jì)算出偶聯(lián)比為13:1。同時(shí)蛋白質(zhì)芯片檢測結(jié)果顯示，偶聯(lián)物與OTAMcAb之間發(fā)生了特異性反應(yīng)，提示完全抗原的存在。通過測定，偶聯(lián)物的蛋白質(zhì)濃度為1.28 mg·mL-1。
　　 試驗(yàn)Ⅱ伏馬菌素B1完全抗原的制備與檢測
　　 為了制備蛋白質(zhì)芯片用探針，本試驗(yàn)采用戊二醛一步法對(duì)FB

6、1與載體蛋白OVA進(jìn)行偶聯(lián)。取1.2 mg的OVA，用PBS溶液配制蛋白質(zhì)懸浮液，濃度為1 mg·mL-1，在磁力攪拌中用蛋白質(zhì)懸浮液溶解1 mgFB1，并逐滴加入相同體積的戊二醛(2％，V/V)，室溫反應(yīng)1 h，用硼氫化納終止反應(yīng)，使硼氫化納的終濃度為10 mg·mL-1，室溫反應(yīng)1 h。最后，在磁力攪拌條件下用PBS于4℃透析72 h。透析液經(jīng)PEG20000濃縮后，進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定。偶聯(lián)后的完全抗原分別進(jìn)行紫外掃描、質(zhì)譜分析和蛋

7、白質(zhì)芯片檢測。紫外掃描顯示，偶聯(lián)物與OVA的波型不同，可初步判斷完全抗原的存在。根據(jù)質(zhì)譜分析偶聯(lián)物的分子量為51928.612，可計(jì)算出FB1與OVA的偶聯(lián)比為9.6:1。同時(shí)蛋白質(zhì)芯片檢測結(jié)果顯示，偶聯(lián)物與FB1 McAb之間發(fā)生了特異性反應(yīng)，提示偶聯(lián)是成功的。通過測定，偶聯(lián)物的蛋白質(zhì)濃度為1.08 mg·mL-1。
　　 試驗(yàn)Ⅲ真菌毒素蛋白質(zhì)芯片的制備與條件優(yōu)化
　　 本試驗(yàn)分別采用腹水制備技術(shù)和飽和硫酸銨沉淀法進(jìn)行

8、了OTA和FB1 McAb的大量制備和純化。首先復(fù)蘇兩種雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。選取20只BALB/c雌性小鼠，注射滅菌液體石蠟，每只0.5 mL，1～2周后注射雜交瘤細(xì)胞懸液，每只0.5 mL，接種量為5×105個(gè)細(xì)胞。試驗(yàn)期間，每天觀察小鼠的生長情況，經(jīng)過10 d左右，待小鼠腹部膨大時(shí)，無菌收集腹水。收集到的腹水采用飽和硫酸銨沉淀法進(jìn)行純化，通過蛋白質(zhì)含量測定，兩種單克隆抗體的濃度分別為1.6 mg·mL-1和1.2 mg·mL-1。

9、
　　 分別對(duì)OTA與FB1完全抗原點(diǎn)樣濃度、單克隆抗體稀釋比例進(jìn)行確定以及完全抗原固定條件、封閉液、封閉時(shí)間，抗原抗體反應(yīng)時(shí)間和羊抗鼠IgG-CY3二抗?jié)舛任鍌€(gè)單因素進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，OTA和FB1完全抗原最佳點(diǎn)樣濃度為30μg·mL-1和40μg·mL-1，單克隆抗體的稀釋比例為1:1600和1:1200。同時(shí)確定4℃過夜固定、0.1％BSA封閉液、37℃封閉1 h、抗原抗體反應(yīng)1 h和2μg·mL-1羊抗鼠IgG-CY3

10、二抗為五個(gè)單因素的最佳實(shí)驗(yàn)條件。以O(shè)TA與FB1標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行間接競爭抑制試驗(yàn)，制定OTA與FB1蛋白質(zhì)芯片檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線，靈敏度(IC50)分別為2.1 ng·mL-1和41.5 ng·mL-1，線性檢測范圍分別為0.5～10 ng·mL-1和10～200 ng·mL-1，線性相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.9934和0.9926，線性關(guān)系良好。
　　 試驗(yàn)Ⅳ蛋白質(zhì)芯片與HPLC檢測方法的比較
　　 在OTA與FB1蛋白質(zhì)芯

11、片檢測的基礎(chǔ)上，進(jìn)行同時(shí)檢測兩種真菌毒素蛋白質(zhì)芯片的研究，以O(shè)TA和FB1標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行間接競爭抑制試驗(yàn)，制定同時(shí)檢測OTA和FB1蛋白質(zhì)芯片的標(biāo)準(zhǔn)曲線，靈敏度(IC50)分別為0.795 ng·mL-1和20.1ng·mL-1，線性檢測范圍分別為0.1～5 ng·mL-1和6.25～100 ng·mL-1，線性相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.9931和0.9917。通過樣品的加標(biāo)檢測，最低檢測限分別為0.5μg·kg-1和12.5μg·kg

12、-1，OTA標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1、5、10μg·kg-1時(shí)，其平均檢出量分別為0.82、4.34和8.24μg·kg-1，最高回收率達(dá)到86.7％，變異系數(shù)均小于10％；FB1標(biāo)準(zhǔn)品濃度為20、50，100μg·kg-1時(shí)，其平均檢出量分別為16.46、44.75和85.72μg·kg-1，最高回收率達(dá)到89.5％，變異系數(shù)均小于10％，線性關(guān)系良好。
　　 建立了OTA與FB1的HPLC檢測方法，并制定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，兩種毒素的檢測

13、范圍分別是1～100 ng·mL-1和0.1～20μg·kg-1，線性相關(guān)系數(shù)(R2)均為0.9999。通過樣品的加標(biāo)檢測，最低檢測限分別為1μg·kg-1和50μg·kg-1，OTA標(biāo)準(zhǔn)品濃度為5、10、50μg·kg-1時(shí)，其平均檢出量分別為3.76、9.08和43.2μg·kg-1，最高回收率達(dá)到90.8％，變異系數(shù)均小于10％；FB1標(biāo)準(zhǔn)品濃度為50、100、500μg·kg-1時(shí)，其平均檢出量分別為37.5、84.5和411.

14、5μg·kg-1，最高回收率達(dá)到84.5％，變異系數(shù)均小于10％，線性關(guān)系良好。
　　 針對(duì)南京地區(qū)收集的玉米、小麥和大米等46份樣品，經(jīng)過提取、凈化后，分別采用蛋白質(zhì)芯片與HPLC檢測樣品中OTA和FB1含量。蛋白質(zhì)芯片檢測結(jié)果顯示，玉米樣品中兩種毒素OTA和FB1的含量偏高，最高值分別為9.58μg·kg-1和469μg·kg-1，3種樣品(玉米、小麥和大米)中兩種毒素的平均檢出率分別為23.4％和29.8％；HPLC檢測結(jié)