7-氨基頭孢烷酸酶法生產(chǎn)的研究.pdf

1、D-氨基酸氧化酶(D-Amino Acid Oxidase，DAAO)和戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸?；?Glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase，GLA)是兩步酶法制備7．氨基頭孢烷酸的重要工業(yè)用酶，頭孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)經(jīng)DAAO催化氧化脫羧反應(yīng)生成戊二?；?．氨基頭孢烷酸(GL-7-ACA)，再在GLA作用下，水解生成7-氨基頭孢炕酸(7-ACA)。

2、 本學(xué)位論文凼繞兩酶法生產(chǎn)7-ACA進(jìn)行了以下方面的研究。 1．以攜帶6個(gè)組氨酸(6<'*>His)的DAAO(HDAAO)編碼序列構(gòu)建三株整合型巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)基因工程菌。在三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子(GAP)控制下胞內(nèi)表達(dá)HDAAO的MMZY03，以及醇氧化酶啟動(dòng)子(AlcoholOxidase．AOX1)啟動(dòng)子控制下分泌表達(dá)菌株MMZY02和胞內(nèi)表達(dá)菌株MMZY01。誘導(dǎo)型重組菌株發(fā)酵培養(yǎng)基選用基

3、本鹽培養(yǎng)基，組成型重組菌株發(fā)酵培養(yǎng)基選用YPD培養(yǎng)基。三種重組菌株在5L自控罐的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)顯示，MMZY03發(fā)酵13 h的產(chǎn)酶達(dá)到7293 U/L。而據(jù)報(bào)道的AOX1控制下表達(dá)量達(dá)到最高需要43 h。然而不論是AOX1的誘導(dǎo)分泌型表達(dá)(MMZY01)，還是GAP啟動(dòng)子的組成型分泌表達(dá)(MMWY01)產(chǎn)酶活力均不高，并不能滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。 2．組成型胞內(nèi)表達(dá)HDAAO的重組P.pastoris MMZY03發(fā)酵后收獲的含DAAO

4、細(xì)胞經(jīng)過壓榨破壁，無細(xì)胞提取液經(jīng)二價(jià)金屬螫合親和層析純化，進(jìn)一步以Amberzyme<'TM>環(huán)氧版樹脂為載體，制得的HDAAO固定化酶活力為75 U/g(濕載體)。該固定化酶連續(xù)用于CPC的酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)14批次，HDAAO的表觀活力并無明顯下降。因此，所構(gòu)建的組成型胞內(nèi)表達(dá)HDAAO的重組P.pastorisMMZY03以及HDAAO固定化酶制備工藝具有潛在的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。 3．D-氨基酸氧化酶屬于黃素蛋白酶。增加酶反應(yīng)系統(tǒng)

5、的內(nèi)部氣壓或通入純氧氣來提高反應(yīng)液中的溶解氧濃度將有助于提高DAAO催化效率。據(jù)報(bào)道，在氧氣缺乏的環(huán)境下，來源于透明顫菌的血紅蛋白(VHb)能提高異源宿主細(xì)胞的生長量。紅酵母來源(Rodotorulagracilis)的DAAO與VHb融合表達(dá)，融合蛋白制備的固定化酶提高了對(duì)CPC的轉(zhuǎn)化效率。我們推測(cè)在體外VHb能起到氧載體作用。本工作分別構(gòu)建了表達(dá)VHb，三角酵母DAAO和VHb融合表達(dá)的蛋白。 分別添加1.0mg游離態(tài)VHb

6、或300 mg固定化VHb，固定化D-氨基酸氧化酶催化頭孢菌素C的比活力與對(duì)照相比分別提高了3倍和2倍。將三角酵母DAAO和VHb融合表達(dá)，制備的固定化酶活力要高于沒有融合的DAAO。 4.在GL-7-ACA?；傅囊徊郊兓⒐潭ɑ难芯恐校瑯?gòu)建了?；窷端組氨酸標(biāo)簽位置和長度均不等的四種重組質(zhì)粒，即pET28GA01，pET28GA02，pET24GA01，pET24GA02。這些重組質(zhì)粒在E.coll BL21(DE3)，宿

7、主細(xì)胞中發(fā)酵表達(dá)，證明BL21(DE3)/pET28GA01的發(fā)酵單位最高，達(dá)到3800 U/L。BL21(DE3)/pET28GA02發(fā)酵單位是2184 U/L。 BL2l(DE3)/pET24GA0l和BL21(DE3)/pET24GA02發(fā)酵單位分別是2092 U/L和754 U/L。經(jīng)對(duì)固定化載體的優(yōu)選確定以FP-IDA-Ni<'2+>樹脂分別對(duì)等量的4種GLA進(jìn)行一步純化，固定化結(jié)果表明固定化酶表觀活力在66.7到80 U/g