剩余污泥酶法水解制備蛋白質、氨基酸及其機理研究.pdf

1、剩余污泥(excess sludge，ES)有機成分中含量最高的是微生物單細胞蛋白質，而微生物單細胞蛋白質是品質好、氨基酸種類齊全的高價值飼料，但尚未得到充分利用。如果應用大量剩余污泥為原料，運用現(xiàn)代食品、生物加工技術，對污泥蛋白資源進行精細加工，生產(chǎn)出動物飼料添加劑，既可綜合利用大宗蛋白質資源，避免和減少資源的浪費，提高剩余污泥的附加值;另一方面將ES蛋白應用于動物飼料中，又擴大了優(yōu)質氨基酸的來源問題。
　　從污泥中提取蛋白質和

2、氨基酸的研究方法為酸水解、堿水解法及其超聲波輔助法，但還存在固定投資大，資金回收周期長，反應條件劇烈，對生產(chǎn)設備要求較高，對環(huán)境造成嚴重污染，且水解產(chǎn)物極易發(fā)生構型改變從而造成水解產(chǎn)物成分極為復雜和蛋白特性變化，導致水解蛋白不能被生物體吸收利用。另外堿性水解易引起幾種氨基酸結構變化或外消旋化。水解產(chǎn)生的廢水處理需要大量的酸堿，處理費用高。
　　本課題針對上述問題，選用蛋白酶水解剩余污泥提取蛋白質，并將其有效轉化為氨基酸，產(chǎn)品純度較

3、高且質量高于國家有關動物飼料標準。此外，利用氧化石墨烯固定化酶反應條件溫和、溫度低、對蛋白質的破壞作用小等特點，發(fā)明一套可循環(huán)利用并提高蛋白質水解率的固定酶酶解方法，利用異硫氰酸苯酯(PITC)高效液相色譜、聚丙烯酰胺凝膠電泳對水解蛋白質、氨基酸進行分離純化和鑒定，利用化學反應動力學原理探討水解參數(shù)與固定酶深度酶解速度之間的關系，在此基礎上探索深度酶解的反應動力學和機理，并對蛋白質氨基酸提取物進行重金屬含量及多環(huán)芳烴(PAHs)含量分析

4、、動物急慢性毒理學研究。
　　論文的主要研究內容及結果如下:
　　(1)剩余污泥主要成分及利用價值分析
　　對選取的ES樣品進行了主要有機組分成分分析，發(fā)現(xiàn)干物質ES中有機質占73.85％，其中脂肪含量約為0.6％，總糖含量為10.2％，蛋白質含量58.1％，此剩余污泥樣品應用于提取蛋白質具有可行性。
　　(2)蛋白酶優(yōu)選及剩余污泥的水解
　　考察了木瓜、堿性、中性、酸性、胰以及胃蛋白酶六種不同蛋白酶對ES

5、蛋白質的提取效果。結果發(fā)現(xiàn)，堿性蛋白酶提取ES中蛋白質提取率最高。其次為中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，胃蛋白酶、酸性蛋白酶和胰蛋白酶的提取效果較差。對堿性蛋白酶水解剩余污泥提取蛋白質的條件進行了優(yōu)化，考察了不同影響因素，得到堿性蛋白酶最適工作條件為:pH值為8.0，溫度55℃，加酶量為2％，反應時間4小時，液固比4∶1。在此工作條件下，52.5％的蛋白質被提取出來，占干污泥重量的30.5％。
　　(3)酶水解剩余污泥機理分析
　　

6、利用SDS-PAGE考察了污泥中蛋白質分布情況，結果表明，不同提取方法的SDS-PAGE蛋白質條帶不同，酶法水解ES蛋白質分子量范圍大約在14-100kDa;通過Michaelis-Menten方程，采用雙倒數(shù)作圖法繪圖，得到堿性蛋白酶催化水解污泥蛋白反應的米氏常數(shù)和最大反應速率分別為Km=34.9 g/L，Vmax=32.2g/(L·min)。以堿性蛋白酶水解污泥蛋白水解度為參數(shù)，推導出反映酶法水解污泥蛋白動力學模型，所建立的模型在一

7、定程度上能模擬水解體系的酶解過程，能較準確地計算出堿性蛋白酶酶解ES蛋白的水解度，理論DH值與實際DH值基本吻合，對酶解過程的實際應用具有很高的利用價值。
　　(4)酶法水解制取氨基酸的分析
　　PITC柱前衍生反相高效液相色譜法可以在35min內同時分析18種氨基酸，18種氨基酸得到完全分離，相鄰氨基酸峰之間均達到基線分離。說明該方法應用在分離氨基酸溶液具有較好的專屬性。利用異硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生反相高效液相色譜

8、法檢測酶法水解污泥氨基酸溶液含有17種氨基酸，分別為必需氨基酸7種和非必需氨基酸10種。人體所必需氨基酸含量高達40％，說明酶法水解剩余活性污泥制備的氨基酸作為家禽家畜飼料應用價值高。
　　(5)蛋白酶固定化及酶學性質考察
　　以氧化石墨烯為基底材料，對堿性蛋白酶進行固定化，得到固定化的最優(yōu)組合，即當溫度為25℃，pH值為8，酶用量為600μL，戊二醛濃度2％時，堿性蛋白酶酶活力回收率可達90％左右;同時對固定化蛋白酶最適工

9、作條件進行了考察，固定酶的最適工作條件是，體系pH為8，溫度60℃;考察了固定化酶的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、儲存穩(wěn)定性以及重復使用性。同時確定了以酪蛋白為底物時的動力學參數(shù)，動力學分析得到游離酶和固定酶的Km常數(shù)分別是4.85和8.57 mg/mL，最大速率常數(shù)Vmax分別是5.7和6.10μg/min。固定酶的米氏常數(shù)是游離酶的1.8倍。
　　(6)固定酶水解制備氨基酸的研究
　　考察了氧化石墨烯固載酶體系水解ES蛋白影響因

10、素，在溫度為65℃，pH值為10，酶用量8 mg/mL，時間為6h條件下，氧化石墨烯固載酶水解剩余污泥氨基酸結果達到8.23 g/100g DS。固定酶與游離酶對剩余污泥粗蛋白質的水解效果幾乎一樣，水解得到的總氨基酸分別是8.23和10.154 g/100g DS。從XRD、XPS、SEM、AFM以及TGA等表征手段分析得出:堿性蛋白酶通過戊二醛交聯(lián)法已經(jīng)成功地固載在氧化石墨烯載體上，并且可以了解氧化石墨烯-堿性蛋白酶復合材料的穩(wěn)定性能

11、。
　　(7)污泥水解產(chǎn)品中重金屬和持續(xù)性有機污染物的分析及對錦鯉的急性毒理學
　　考察了污泥及蛋白質制品中重金屬微量元素(Cu，Ni，Zn，F(xiàn)e，Mn)和有害重金屬(Pb，Cr，Cd，Hg，As)等金屬的含量，發(fā)現(xiàn)污泥中鐵的含量非常高，達到10247.59 mg/kg DS。另外，污泥中除鋅含量超標外，基本都在1984年頒布的《農(nóng)用污泥中污染物控制標準》(GB4284-84)的限值之內。酶法污泥蛋白提取液中重金屬微量元素析

12、出量和有害重金屬浸出量遠遠小于堿法、酸法提取污泥蛋白。酶法提取污泥蛋白質中有害重金屬Pb、Cr、Cd、Hg、As的含量均低于飼料衛(wèi)生標準(GB13078-2001)，其中Pb浸出率最高。
　　經(jīng)微波消解、固相微萃取后，采用GC/MS分析方法，檢測了污泥、三種不同方法提取的污泥蛋白及酶提污泥蛋白飼喂錦鯉魚體內的18種多環(huán)芳烴含量，結果發(fā)現(xiàn)，堿法提取的污泥蛋白中，∑PAHs含量最高，酸法次之，酶法提取的污泥蛋白∑PAHs最少，最安全。

13、同時考察了酶法提取粗蛋白作為飼料的安全性，錦鯉體內∑PAHs和致癌性多環(huán)芳烴(∑PAHscare)含量普遍比較低。
　　總之，本文選用ES為研究對象，利用堿性蛋白酶以及固定化堿性蛋白酶酶法水解為研究方法，系統(tǒng)研究了游離酶與固定酶酶法水解ES中蛋白質、氨基酸，對其水解特性及水解動力學進行了深入探討。此外，重點考察了酶法提取ES粗蛋白中有毒有害金屬及重金屬、PAHs含量分析，以及ES粗蛋白應用在錦鯉魚飼料上的初步研究。本研究為蛋白酶在