截短型rBTI的表達(dá)、純化及性質(zhì)研究.pdf

1、蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor, PI)是一類可以作用于蛋白酶，并對(duì)其有抑制活性的小分子肽或者蛋白質(zhì)。蛋白酶抑制劑廣泛分布在自然界中，以多種形式存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)。有機(jī)體中許多重要的生理學(xué)過(guò)程都需要依賴蛋白酶抑制劑對(duì)蛋白酶精確的調(diào)控作用來(lái)正常進(jìn)行。根據(jù)抑制劑作用于蛋白酶的活性位點(diǎn)，可以將蛋白酶抑制劑分為五類:絲氨酸蛋白酶抑制劑，蘇氨酸蛋白酶抑制劑，半胱氨酸蛋白酶抑制劑，天冬氨酸蛋白酶抑制劑以及金屬蛋白酶抑制

2、劑。研究人員對(duì)絲氨酸蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理以及生物學(xué)活性等方面的研究較為深入。胰蛋白酶抑制劑(Trypsin Inhibitor, TI)屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑。植物來(lái)源TI的多樣性以及豐富性使得它們成為了研發(fā)具有藥理學(xué)特性的新蛋白類藥物的資源。
　　蕎麥（Fagopyrum esculentum Moench.）屬蓼科植物，作為一種藥食同源作物，它含有豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)以及黃酮類物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)室先前通過(guò)基因工程技術(shù)獲得一種

3、重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑（recombinant Buckwheat Trypsin Inhibitor, rBTI），該抑制劑能夠?qū)Ｒ恍缘囊种埔鹊鞍酌傅幕钚浴Ｍㄟ^(guò)氨基酸定點(diǎn)突變確定Arg45為rBTI的活性區(qū)域氨基酸， X-射線晶體衍射實(shí)驗(yàn)顯示，在69個(gè)氨基酸組成的rBTI分子結(jié)構(gòu)中含有一段α-螺旋和兩端β-折疊，其余為線性區(qū)域。功能分析表明，該抑制劑具有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。
　　為了揭示rBTI的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，本研

4、究根據(jù)rBTI的氨基酸序列及分子結(jié)構(gòu)，將其C-端區(qū)的VVM，TPVVM，VDTPVVM分別進(jìn)行截短，構(gòu)建了3個(gè)截短型重組質(zhì)粒pExsecI-rBTI-t1、pExsecI-rBTI-t2和pExsecI-rBTI-t3，并實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌BL21中的可溶性表達(dá)。通過(guò)ResourceQ陰離子交換層析和Superdex75分子篩層析分離純化，目的蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝膠圖譜中顯示單一條帶，純度高達(dá)98％以上。胰蛋白酶抑制活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，

5、與野生型rBTI相比，截短型rBTI仍具有較強(qiáng)的胰蛋白酶抑制活性，可能是由于C-末端氨基酸的缺失并沒有影響到rBTI活性中心和必須基團(tuán)氨基酸的改變，所以保留了較為完整的胰蛋白酶抑制活性。理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，3個(gè)截短型rBTI均具有良好的酸堿穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性，在pH2.0-10.0的范圍內(nèi)和高溫處理60min后，仍具有較強(qiáng)的胰蛋白酶抑制活性。圓二色光譜分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)這3個(gè)截短型突變體的二級(jí)結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯變化。體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞核

6、形態(tài)觀察結(jié)果顯示，截短型rBTI對(duì)EC9706（人食管癌細(xì)胞）具有一定的生長(zhǎng)抑制作用，并呈劑量依賴性。
　　本研究采用截短突變技術(shù)，通過(guò)原核系統(tǒng)表達(dá)和兩步分離純化獲得了3個(gè)截短型抑制劑rBTI-t1、rBTI-t2和rBTI-t3。理化性質(zhì)和體外腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，rBTI C-末端氨基酸的缺失并未引起其活性區(qū)域或功能部位的較大改變。表明C-末端63-69的氨基酸對(duì)于抑制劑與蛋白酶的結(jié)合沒有必然的關(guān)系。這些結(jié)果為深入開展rBTI結(jié)構(gòu)